不同靈芝、多孔菌樣品對LN-CaP和A549細胞生長的影響

Xinhe Shan 翟云燕 吳金洋 柯傳奎*

（1.chapman parkway ,stonybrook, NY, US. 11790；2.杭州柯氏生物科技有限公司，浙江 杭州 310053）

中國兩千年前的《神農本草經》將靈芝按菌蓋和菌柄的顏色（赤、黑、青、白、黃、紫）分類，統稱“六芝”，并記載各自的功效。中國明朝太醫院·劉文泰等纂修的《本草品匯精要》[1]記載靈芝有赤芝、黒芝、青芝、白芝、黃芝、紫芝。它們的產地、中藥的“性”、功效與主治的疾病見表1。

表1 六芝的產地、中藥的性、功效與主治

記載“六芝”的共同功效為“久服輕身，不老延年，神仙”[1]。根據中醫藥理論對各種靈芝的“功能主治”分析，“六芝”涉及到中醫的歸經：心、肝、脾、肺、腎，而黒芝和紫芝都是以歸腎經為主。提示：不同產地、不同品種的“靈芝”可能有不同的生理效應。

當今對“六芝”的具體生物物種說法不一，菌類分類專家趙繼鼎[2]對“六芝”經初步考證認為：赤芝是靈芝屬的靈芝（Ganoderma lucidum）；紫芝是靈芝屬的紫芝（Ganoderma sinense）；黃芝可能是硫磺菌（Laetiporus Sulphureus）；白芝可能是苦白蹄（Fomitopsis officinalis）；黑芝可能是靈芝科假芝屬的種類，尤以假芝（Amauroderma Sugosum）最相似，也可能是多孔菌屬的黑柄多孔菌（Polyporus Melanopus）；青芝可能是云芝（Coriolus versicolor）。

中華人民共和國藥典（2010年一部）在靈芝項下只指赤芝（Ganoderma lucidum）或紫芝（G. sinense）的干燥子實體[3]。但是在中國文獻和市場上的“靈芝”可能涉及到靈芝科（Ganodermataceae）和多孔菌科（Polyporaceae）的許多個屬和種，往往沒有注明拉丁種名。雖然，有實驗報告[4]表明，赤芝主要通過靈芝三萜成分阻斷I、II型5α-還原酶，而靈芝醇B可以和雙氫睪酮受體結合。并且指出靈芝的乙醇及甲醇提取物均能顯著地抑制睪酮誘導的 BPH大鼠的腹側前列腺的增長。但文中忽視了生物學分類中數以百計的靈芝科和多孔菌科物種及產地對其乙醇及甲醇提取物含量、成分組成，尤其是忽視了給藥量對藥效的影響。所以，中醫臨床常用靈芝配伍的處方，由于藥材來源問題，臨床療效不穩定。

本實驗通過細胞培養人激素依賴性前列腺癌細胞株（LN-CaP）和肺腺癌細胞株（A549），在細胞培養液中加入不同濃度的各種靈芝的水提取液或不同濃度的丙酸睪酮，實時記錄細胞生長曲線，重點分析各種樣品對以上細胞株的生理效應，探討樣品給藥量與其效應的關系。

1 材 料

（1）不同靈芝樣品的形態記錄見表2。

（2）細胞株、試劑和實驗儀器。前列腺癌細胞株為人激素依賴性前列腺癌細胞株（LN-CaP），由北大紹興生物中心贈送；肺腺癌細胞株A549購于美國ATCC。其他試劑和實驗儀器有：RPMI1640培養基（美國Hyclone），0.25%TRYPSIN（美國Hyclone），胎牛血清（美國Hyclone），丙酸睪酮（上海通用藥業股份有限公司，批號121201），無水乙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），培養皿（上海圣納堡生物科技開發有限公司），培養箱（美國Thermo Fisher Scientific），倒置顯微鏡（日本 OLYMPUS），xCELLigence和 96 孔微電子細胞芯片由艾森（杭州）生物有限公司生產[7]，離心機1（上海HealForce），離心機2（德國Eppendorf），水浴鍋（上海博迅實業有限公司），超聲機（昆山市超聲儀器有限公司），金屬浴（杭州奧盛儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 靈芝樣品的水提

將樣品切碎為直徑0.5 cm 大小，置60 ℃烘箱中烘干至恒重。用打粉機將樣品粉碎成50～200目的粉末。參照《中國人民共和國藥典》2010年版一部（P175）靈芝用量6～12 g[3]的中間值9 g，計算細胞培養液中含藥量按照《藥典》中人體用藥的千分之一（9 mg·mL-1）。稱取1.296g樣品，放入15 mL離心管，加入9 mL純水，旋渦振蕩器混勻，冷水浸泡30 min。超聲機超聲處理5 min；置水浴鍋，99.9℃水浴1 h；超聲10 min，5 000 rpm離心15 min；再用高速離心機，10 000 rpm離心10 min；每個樣品吸取上清液2 mL，用金屬浴99.9 ℃濃縮至500 μl，4℃保存。實驗前先做不同給藥濃度的梯度預實驗，選擇最佳給藥濃度做正式實驗。

2.2 丙酸睪酮的配制

市售原注射液濃度 25 mg·mL-1，用細胞生長培養基和無水乙醇配制成 0.25 mg·mL-1～2.5×10-6mg·mL-1，其中無水乙醇濃度為1.6%。細胞培養實驗時取配制好的不同濃度丙酸睪酮10μl，加入到150μl細胞培養液中，使丙酸睪酮的終濃度為 1.5×10-9～1.5×10-3mg·mL-1。

2.3 xCELLigence系統檢測不同樣品細胞圖譜

采用xCELLigene系統96 孔微電子細胞芯片[7]，加入細胞生長培養基，50μl /孔，將96 孔微電子細胞芯片放到 xCELLigence系統上測基線。用胰酶消化細胞，并計數，配制細胞濃度，每個孔接種100 μl細胞懸液，LN-CaP細胞接種密度為每孔2×104個細胞，檢測48 h后加入“靈芝”樣品，使樣品提取液終濃度為 2.5 mg·mL-1，5 mg·mL-1，10 mg·mL-1，120 mg·mL-1，150 mg·mL-1。丙酸睪酮終濃度為1.5×10-9～1.5×10-3mg·mL-1（無水乙醇終濃度為0.1%），對照組不加藥物，陰性對照只加0.1%無水乙醇。A549細胞每孔接種密度6 000個細胞，檢測20 h后加入不同體積樣品提取液，使細胞培養孔內的終濃度為 20 mg·mL-1，40 mg·mL-1，80 mg·mL-1，100 mg·mL-1，120 mg·mL-1，對照組 Ctr不加藥物。各種樣品加入到受試細胞后通過xCELLigene系統來測量細胞狀態的改變，包括細胞數量、細胞粘附、細胞活力和細胞形態等。數據分析使用 RTCA 軟件，對每孔的數據在樣品添加前時間點進行標準化處理。將檢測結果數據導出至Microsoft Excel，進行后續處理。通過xCELLigence 系統連續監測可獲取動態細胞效應曲線（細胞圖譜）[8,9,10]。（說明：人肺腺癌細胞株A549生長較快，選擇培養20 h后加藥。人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP細胞倍增時間長，生長緩慢，選擇培養48 h后加藥。）

表2 不同靈芝樣品的產地和形態記錄

3 結 果

3.1 不同濃度靈芝樣品的LN-CaP細胞圖譜

將1#～9#靈芝樣品按上述操作方法，為便于比較，將每條曲線合并到一個坐標圖內。不同濃度的樣品作用于 LN-CaP 的細胞生長圖譜見圖 1、圖 2：樣品 1#～9#在 2.5、5.0、10 mg·mL-1，1#～8#在 2.5～10 mg·mL-1對LN-CaP細胞作用不明顯(圖1 A～C）；唯有樣品9#在2.5～10 mg·mL-1對LN-CaP細胞呈與眾不同的生長曲線，即對LN-CaP細胞生長抑制呈濃度梯度依賴(圖1 D）。

將樣品1#～8#的濃度加大到120、150 mg·mL-1，顯示抑制LN-CaP細胞生長且具有差異（圖2）。

3.2 不同濃度靈芝樣品的A549細胞圖譜

1#～8#靈芝樣品不同濃度對A549細胞生長的影響見圖3（A-H），樣品質量濃度大于40 mg·mL-1時對細胞生長抑制作用明顯。

圖1 低濃度靈芝樣品的LN-CaP細胞圖譜

圖2 高濃度靈芝樣品的LN-CaP細胞圖譜

3.3 不同濃度丙酸睪酮的LN-CaP細胞圖譜

因為已有文章報道[4]抑制睪酮誘導的BPH大鼠的腹側前列腺的增長，本實驗采用人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP，在觀察不同濃度靈芝作用情況的同時觀察丙酸睪酮對LN-CaP細胞生長的影響（圖4）：陰性對照0.1%EtOH較對照Ctr沒有受到明顯影響，丙酸睪酮在較低濃度1.5×10-9、1.5×10-8mg·mL-1時，刺激 LN-CaP 細胞增殖；而在較高濃度 1.5×10-7～1.5×10-3mg·mL-1時，對 LN-CaP 細胞的生長起抑制作用。

圖3 不同濃度靈芝樣品的A549細胞圖譜

4 討 論

實時細胞記錄儀器xCELLigence系統[7]通過微電極整合在細胞培養孔的底部，能自動、連續地監測測量電阻來反映細胞生長狀態，獲取細胞全過程動態信息。Huiying Fuet[11]使用xCELLigence系統，以三百五十多種中藥材和青藏高原產地采集的十多種冬蟲夏草為例，建立了道地藥材的鑒別方法，推測中藥材的作用機理和作用部位（受體），利用非線性的量效關系判斷有效成分高低，篩選真菌菌種，篩選已知藥物的抑制劑，提出生物物種的演化關系。本實驗使用xCELLigence系統，參照以上的鑒別中藥材的方法，得到啟示。

市面上“靈芝”類產品從生物學分類上看，分別涉及到靈芝科和多孔菌科的屬和種，古文獻早就記載了靈芝的產地、形態和功效的關系，而中國藥典只記載多孔菌科（現代分類為靈芝科）靈芝屬的赤芝和紫芝，靈芝項下的“歸經”：心、肺、肝、腎。從圖1、2看出，樣品1#～8#在 2.5～10 mg·mL-1加藥量時抑制作用有差異，但差異不明顯，而在 20～120 mg·mL-1時，各種“靈芝”呈現出明顯的差異。樣品1#，系云南麗江的野生黑芝，在80 mg·mL-1以上對人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP有抑制作用；樣品2#～8#，抑制濃度分別為40，80，20，80，40，40，80 mg·mL-1。其中西藏林芝產的赤芝（樣品6#）對人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP和肺腺癌細胞株A549作用最強。提示用于治療前列腺疾病的用量按中醫習慣用量和藥典用量可能偏低，鑒于在高濃度120 mg·mL-1和150 mg·mL-1時抑制作用比較明顯，為此，建議中藥處方用量應該增加到20～40 g·d-1以上，而且需要考慮靈芝的產地和品種。

圖4 不同濃度的丙酸睪酮對LN-CaP細胞生長圖譜

從圖3看出，丙酸睪酮對人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP有生理效應，在濃度小于1.5×10-7mg·mL-1時有促進作用，而大于1.5×10-5mg·mL-1有抑制作用，而且呈非線性的量效關系。前列腺癌較多發生在老年男性而不在青壯年，可能是青壯年時期體內的雄激素濃度較高，對前列腺癌的發生起抑制作用；而老年時期的雄激素濃度下降，可能會對前列腺癌的發生起促進作用，因此，前列腺癌的發病率反而增加。這與老年男性因雄性激素分泌下降導致前列腺肥大的現象一致。提示常用促進雄性激素分泌的中藥“補腎藥”，可能對預防前列腺肥大或前列腺癌有益。

從圖1發現樣品9#（吉林產的樺褐孔菌）在2.5 mg·mL-1低濃度時顯示出與眾不同的細胞圖譜，圖1-D顯示2.5～10 mg·mL-1的非線性抑制關系，這是否提示：樺褐孔菌對人激素依賴性前列腺癌細胞株LN-CaP的生理活性高于靈芝樣品1#～8#，有進一步研究的價值。

以上實驗提示，來自不同產地的靈芝，可能存在真菌生理菌種不同，而導致臨床作用的強度不同，認為有必要用以上方法選擇菌種，以使產業化后的產品穩定有效。

美國編著者凱西麗醫生談中草藥保健品及流行療法的中文版《傳聞與真相1》[12]第188頁“科研證據”項下記載，“緩解下泌尿道癥狀：88位男性，有輕度到中度泌尿道癥狀，被給予一種靈芝提取物（每天6毫克）或安慰劑，為期12周。相比安慰劑，靈芝提取物較大幅度改善下泌尿道癥狀，也沒有不良反應的報告”。這個信息說明，靈芝有可能是一種副作用小且能治療下泌尿道癥狀疾病的中草藥。遺憾的是，以上記載也沒有注明靈芝的產地、種名和靈芝提取物的得率。

[1] 明·劉文泰, 等. 《本草品匯精要》[M]. 華夏出版社, 2004, 1： 125-127.

[2] 趙繼鼎.我國古籍中記載六芝的初步考證[J].微生物學通報,1989, 3：180-181.

[3] 國家藥典委員會.《中華人民共和國藥典》.一部.2010年版[S].中國醫藥科技出版社,2010：174-175.

[4] Ryuichiro Kondo et al. Utility of functional mushrooms in aging society——The preventative effect of benign prostatic hyperplasia and osteoporosis by Ganoderma lucidum[C], Proceedings of China-Japan Pan Asia Pacific Mycology Forum Symposium, 2008：35-36.

[5] 張小青, 趙繼鼎. 《中國真菌志》第十八卷靈芝科[M]. 科學出版社, 2000： 30-165.

[6] 劉波. 《中國藥用真菌》第二版[M]. 山西人民出版社, 1978, 5： 103.

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[12] 凱西麗（美）等主編, 劉愛民等翻譯. 傳聞和真相1[M]. 江蘇科學技術出版社, 2012, 9： 188.