湖南十字花科作物根腫病菌生理小種鑒定

彭沙莎 ，任佐華 ，黃小莉 ，劉敏捷 ，孫良菲 ，劉二明

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科技學(xué)院，長(zhǎng)沙，410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

十字花科作物根腫病是一種全球性的土傳病害，由蕓薹根腫病菌 （Plasmodiophora brassicaeWoron）侵染引起，該病在中國(guó)大部分省、市、自治區(qū)均有分布[1，2]。在利于病害發(fā)生的環(huán)境下，根腫病可導(dǎo)致十字花科作物嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收，且發(fā)病后的土壤將長(zhǎng)期帶菌，不再適宜栽培十字花科作物[3～5]。1984年，湖南地區(qū)首次報(bào)道有根腫病害發(fā)生[6]，僅長(zhǎng)沙地區(qū)發(fā)病面積達(dá)到66.7 hm2。

目前，培育和種植抗根腫病品種被認(rèn)為是防治根腫病最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的措施[7，8]。但是，蕓薹根腫病菌是一種不可人工培養(yǎng)的專(zhuān)性寄生菌，不同地區(qū)和不同品種中均存在著病菌生理小種分化現(xiàn)象[8，9]。

國(guó)際上通用的根腫病生理小種鑒別系統(tǒng)有兩個(gè)，分別是Williams鑒別系統(tǒng)[10]和歐洲根腫病菌鑒別寄主（ECD）系統(tǒng)[11]。鑒于ECD系統(tǒng)共有15個(gè)鑒別品種，鑒定時(shí)需要栽培大量植株，且當(dāng)鑒定菌株數(shù)量較多時(shí)，對(duì)鑒定場(chǎng)地的需求大，工作量也大，鑒定條件不易保持一致[12]，而Williams鑒別系統(tǒng)因具有鑒別寄主少、使用方便、容易理解[13]等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。本研究采用Williams鑒別系統(tǒng)首次對(duì)湖南4個(gè)地區(qū)十字花科作物根腫病主要發(fā)病區(qū)域的病菌進(jìn)行生理小種鑒定，旨在為今后湖南省十字花科作物抗病育種、抗源篩選及抗性品種布局提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試病株采自湖南省懷化、益陽(yáng)、株洲和長(zhǎng)沙4個(gè)地區(qū)十字花科作物大白菜、紅菜薹、榨菜和油菜種植病區(qū)（表1）。將洗凈后的單株裝入密封袋，編號(hào)，置于-20℃冰箱中保存。

Williams根腫病菌鑒別系統(tǒng)的4個(gè)鑒別寄主，即 2 個(gè)結(jié)球甘藍(lán)品種 Jersey Queen（J.Q.）、Badger Shipper（B.S.），2 個(gè)蕪菁甘藍(lán)品種 Laurentian（L.T.）、Wilhelmsburger（W.B.），均由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)十字花科作物根腫病生理小種鑒定品種育種室提供。感病品種為四季奶油小白菜，購(gòu)于長(zhǎng)沙馬王堆蔬菜批發(fā)市場(chǎng)。育苗基質(zhì)為播種專(zhuān)用營(yíng)養(yǎng)土，由盛泰（香港）園藝科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

①接種菌液的制備 取保存于-20℃冰箱中的單株根瘤30 g勻漿，配制成200 mL菌液。利用Neubauer血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將菌液中的孢子濃度調(diào)至24×107個(gè)/g，將菌液加入到600 g已滅菌2 h的育苗基質(zhì)中，攪拌均勻，菌土的含水量以手握成團(tuán)、觸之即散為宜，24℃避光密封發(fā)酵48 h以上，其菌土中病菌休眠孢子濃度為 4×107個(gè)/g[14，15]。

②接種方法 將已滅菌2 h的育苗基質(zhì)裝入營(yíng)養(yǎng)缽（規(guī)格為8 cm×8 cm），澆足底水使基質(zhì)濕潤(rùn)，營(yíng)養(yǎng)缽中心用實(shí)心棒插一深3 cm、直徑2 cm的圓穴，置入已制備好的病菌土。每份病菌土分裝100缽（4個(gè)鑒別寄主和1個(gè)感病品種各20缽），每缽播4粒種子，且直接播在置入的病菌土之上，每份菌土保苗40株以上[16～19]。在播完種之后，必須使用不同的托盤(pán)擺放，避免交叉感染[20]。播種后苗床的溫度控制在25℃，土壤濕度保持在90%，pH值控制在6～7[19，21]，為根腫病菌的發(fā)病營(yíng)造良好條件。

③病情調(diào)查 出苗后45～60 d（大約8片真葉）進(jìn)行病情調(diào)查與統(tǒng)計(jì)，病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)由農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)“十字花科作物根腫病防控技術(shù)研究與示范”項(xiàng)目組制定。

0級(jí)：根部無(wú)腫瘤；1級(jí)：側(cè)根有小腫瘤；3級(jí)：主根腫大，其直徑小于2倍莖基部；5級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的2～3倍；7級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的3～4倍；9級(jí)：主根腫大，其直徑是莖基部的4倍以上或腫大的根部變黑。

計(jì)算公式： 發(fā)病率（%）=（病株數(shù)/調(diào)查株數(shù)）×100%；病情指數(shù)=[∑（各級(jí)發(fā)病株數(shù)×級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病情級(jí)數(shù)）]×100；病情指數(shù)＜10為抗病，病情指數(shù)≥10為感病[22]。

表1 供試病樣來(lái)源

表2 Williams根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)

④生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn) 依照病菌在4個(gè)鑒別寄主上的致病反應(yīng)型，具體見(jiàn)表2，按Williams根腫病菌生理小種鑒別系統(tǒng)劃分生理小種[10]。

2 結(jié)果與分析

來(lái)自湘西南懷化、湘北益陽(yáng)、湘中株洲和長(zhǎng)沙4個(gè)地區(qū)的十字花科作物大白菜、榨菜、紅菜薹和油菜根腫病株共12份，由表3可知，依據(jù)Williams鑒別系統(tǒng)，鑒定出4個(gè)根腫病菌生理小種，即1、4、9和13號(hào)，它們?cè)诓又谐霈F(xiàn)的頻率分別為16.7%、33.3%、16.7%和33.3%。

從寄主生理小種組成看，大白菜根腫病菌生理小種有1號(hào)、4號(hào)、9號(hào)和13號(hào)，榨菜根腫病菌生理小種為1號(hào)，紅菜薹根腫病菌生理小種有4號(hào)和9號(hào)，油菜根腫病菌生理小種有4號(hào)和13號(hào)；從地區(qū)生理小種分布來(lái)看，湘西南懷化大白菜根腫病菌為生理小種1號(hào)和13號(hào)、榨菜根腫病菌為生理小種1號(hào)，湘北益陽(yáng)紅菜薹根腫病菌為生理小種4號(hào)，湘中株洲油菜根腫病菌為生理小種4號(hào)和13號(hào)，湘中長(zhǎng)沙大白菜和紅菜薹根腫病菌生理小種均為9號(hào)。

3 小結(jié)與討論

本研究利用Williams鑒別系統(tǒng)對(duì)湖南4個(gè)地區(qū)十字花科作物大白菜、榨菜、紅菜薹和油菜共12份根腫病株進(jìn)行了鑒定，確定了 1、4、9、13號(hào)4個(gè)生理小種。鑒定結(jié)果顯示，同一地區(qū)的相同寄主病株根腫病菌生理小種存在不同，如湘中株洲的油菜病株，經(jīng)鑒定得到4號(hào)和13號(hào)2個(gè)生理小種；同一地區(qū)的不同寄主病株根腫病菌生理小種也存在不同，如湘西南懷化的大白菜根腫病菌為生理小種1號(hào)和13號(hào)、榨菜根腫病菌為生理小種1號(hào)，不同品種的寄主因根腫病菌存在致病性分化，其抗感反應(yīng)表現(xiàn)也不同。

表3 湖南十字花科作物根腫病菌生理小種鑒定

目前，國(guó)內(nèi)十字花科作物根腫病菌生理小種研究?jī)H在大白菜根腫病菌中有報(bào)道。沈向群等[23]對(duì)采自遼寧、吉林、山東和四川等15個(gè)主要發(fā)病區(qū)域的大白菜根腫病菌進(jìn)行了鑒定，其中11個(gè)地區(qū)的根腫病菌的種群以4號(hào)生理小種為主，同時(shí)發(fā)現(xiàn)2、7、10、11號(hào)生理小種菌株各1個(gè)。本研究中湖南大白菜根腫病菌生理小種有1、4、9和13號(hào)，不同地區(qū)的大白菜根腫病菌生理小種不同。

本研究初步確定了湖南4個(gè)地區(qū)十字花科作物大白菜、紅菜薹、榨菜和油菜的根腫病菌的生理小種組成，但要明確湖南省十字花科作物根腫病菌的生理小種組成，需要更廣泛地調(diào)查和取樣，進(jìn)一步開(kāi)展生理小種的鑒定工作。

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