藥物肝損傷的潛在生物標志物循環miR－122的研究進展

王 雁，湯納平，馬 璟

(中國醫藥工業研究總院國家上海新藥安全評價研究中心，上海 201203)

據報道，肝毒性成為上市藥物被召回的主要原因[1]，在FDA批準上市的藥物中，80%以上的黑框警告藥物屬于嚴重肝損傷藥物[2]。目前國際上認可的臨床前安全性評價技術指導原則中，有關肝毒性的評價主要從臨床生化指標如血清轉氨酶和總膽汁酸等、組織病理學和超微病理學、活性代謝產物及免疫相關指標4個方面進行評價[3]。然而這些常規的毒理學研究終點均因靈敏性、穩定性和特異性較差而不能為肝毒性評價提供早期準確的信息。例如，目前肝損傷評價的“金標準”丙氨酸轉氨酶(alanine transaminase，ALT)和天冬氨酸轉氨酶(aspartate aminotransaminase，AST)，在檢測肝損傷過程中有很多局限:①在腎損傷和骨骼肌損傷時也可檢測到血清ALT升高[4－6];② 血清ALT水平要達到對照組的2～4倍才能被認為是肝損傷，臨床上很容易錯過肝損傷最佳治療時期[3，7];③ 出現假陽性或假陰性，如非諾貝特可以誘導血清轉氨酶升高但卻無明顯的肝損傷。近幾年來，隨著分子生物學技術的發展，使大規模篩選靈敏可靠的肝毒性生物標志物成為可能[8－11]。然而，迄今為止仍未發現比ALT和AST更具有優越性的生物標志物。目前，大量的驗證性研究正在進行中。

微RNA(microRNA，miRNA)是一類全長為19～25個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，由莖環狀結構的轉錄前體加工而成。在進化上高度保守[12]，通過與靶mRNA 3'端部分或完全互補，可以抑制靶mRNA翻譯或降解靶mRNA從而調控靶基因的表達。因此在機體生理和病理過程中起著很重要的作用。隨著miRNA鑒定方法的改進，越來越多的miRNA被克隆，并根據克隆的先后順序在miR后加上阿拉伯數字來命名，如 miR－1。研究表明，肝特異性表達的miR－122參與肝細胞發育、表型、分化代謝和應激應答等過程[13－16]。與傳統的肝毒性評價指標相比，循環 miR－122可以有效地區分肝損傷和肝外損傷[17－18]，且比傳統的蛋白指標反應靈敏[13，19]，預測性較好[17]，與組織病理學結果具有很高的相關性，在個體之間的反應較一致[19－20]。因此，與成分比較復雜、易變性、易降解的蛋白質相比[21－22]，豐富而穩定的短鏈循環miR－122有望成為藥物肝毒性臨床前安全性評價的生物標志物[23－24]。

理想的生物標志物需具備高特異性、靈敏性和非侵襲性等特征(表1)[25]，因此，本綜述將從穩定性、特異性和靈敏性3個方面闡述循環miR－122作為藥物肝毒性安全評價指標的潛在優勢。

表1 理想生物標志物的特征

1 循環miR－122的來源及穩定性

2008年，Lawrie等[26]首先發現了循環血液中 miRNA的存在，這一重大發現為miRNA作為非侵襲性標志物以及應用在癌癥疾病的預防和診斷方面奠定了基礎。隨后，Mitchell等[27]和 Chen 等[24]報道血漿或血清中存在穩定的miRNA。

1.1 循環miR－122的來源

外周血miR－122在病理狀態下表達水平明顯升高，顯示其作為肝損傷特異性生物標志物的潛能。但循環miR－122的來源及與肝組織細胞中miR－122的關系尚不清楚。Wang等[13]在小鼠暴露對乙酰氨基酚24 h后，分別檢測小鼠肝和血清中 miRNA的表達譜發現，與對照組相比，小鼠肝miR－122的表達顯著性降低，而血清miR－122的表達升高最明顯。并推測，血清中miR－122的升高可能像血清ALT和AST一樣是由壞死和受損細胞漏出或分泌所致，但這一推斷還需要進一步實驗證實。

Chen等[24]發現，機體正常狀態下，循環miRNA的表達譜和血細胞miRNA表達譜有較高一致性，而病理狀態循環miRNA表達譜和正常機體血細胞miRNA表達譜相關性很低，與損傷機體血細胞miRNA的差異也增大。這說明在正常狀態下，血清miRNA主要是由血細胞分泌而來，而在組織病變時，血清 miRNA主要來自受損的組織細胞。關于miRNA如何從組織細胞進入血循環中，主要有2種推測[28－30]:① 被動漏出;② 主動分泌。目前已有一些研究證實了miRNA的主動分泌[31－33]。這些也都為循環 miR－122的來源提供了線索。McDonald等[34]研究發現，在游離血紅蛋白濃度達到12.0 g·L－1時，溶血現象對循環 miR－122的表達無任何影響，這與正常狀態下血循環中miRNA來源于血細胞有悖。因此，循環miR－122的來源及其與肝組織細胞miR－122的關系仍需要深入研究。

1.2 循環miR－122的穩定性

研究表明，循環miRNA在外周血中可以高度穩定地存在[24，27]。Chen 等[24]通過研究不同條件(高溫煮沸、低/高pH、長期儲存和反復凍融等)處理后的血漿miRNA表達水平，結果顯示，這些處理條件下的miRNA與未處理的血漿中miRNA表達水平并無明顯差異。為了證明miRNA可以抵制血漿RNA酶的降解，在消化和未經消化處理的RNA酶A血漿樣品中，通過RT－PCR分析表明，RNA酶A對血漿中miRNA并沒有產生影響，3 h之內仍保持完整結構。因此，相對于成分比較復雜、易變性和易降解的代謝物，循環miRNA更適宜作為生物標志物。

目前，關于體液miRNA能夠穩定存在的原因仍在研究中。研究顯示，循環中miRNA被細胞分泌的胞外體或微泡等包裹，并且由它們的膜性結構保護[35－36]。Turchinovich 等[37]在研究胞外miRNA特征時，證明miRNA之所以在細胞外能長期穩定存在，主要是因為形成了一種miRNA/Ago2復合體，而該復合體可以有效地抵抗核酸酶/蛋白酶。關于循環miR－122穩定的確切分子機制仍需要進一步研究。

2 循環miR－122生物標志物的肝特異性

2.1 肝組織的高表達

Lagos－Quintana 等[38]通過克隆成年小鼠特定組織的miRNA以確定miRNA在不同組織分布的實驗中證明，miR－122占所有肝克隆的miRNA的72%，并且在其他組織中未檢測到miR－122的表達。Chang 等[39]進一步使用 RT－PCR 檢測miR－122在成年大鼠的不同組織的表達水平，其中在成年大鼠肝中，每個肝細胞的miR－122的表達水平高達50000拷貝。而在肺、脾、心臟和骨骼肌的表達幾乎檢測不到。

Baskerville等[40]利用微陣列芯片表達譜技術研究了175種miRNA在人類24個組織器官中的表達，通過對175種miRNA表達譜的層級聚類分析得到各種miRNA在不同組織的表達特異性，其中miR－122在肝中相對表達量為1000，而在其他組織相對表達量均≤10。

Kim等[41]通過挖掘有關研究miRNA表達譜的文獻，并對每個相對獨立的表達譜進行相關性分析和SOM算法聚類分析，結果表明，miR－122在肝中表達信號最強而在其他組織表達信號很低甚至無信號。

上述關于miRNA的表達分析表明，miR－122在肝中高度表達，在其他組織表達很低甚至檢測不到，其表達量占肝中所有miRNA的70% 以上。因此，通過檢測外周血中miR－122的變化，就可以預測藥物對肝是否有損傷作用，從而也可以預測新藥的毒性作用靶點。

2.2 與肝損傷的相關性

Starkey Lewis 等[17]研究了循環 miR－122 與對乙酰氨基酚急性中毒的關系，并進一步檢測了外周血中腦組織高度表達的miR－128、肝組織高度表達的miR－129和心臟富集的miR－1的變化。與對照組相比，肝組織高表達的miR－122有顯著性升高，血清miR－218無明顯改變。通過Pearson相關性分析，對乙酰氨基酚急性中毒組血清miR－122表達水平與血清ALT活性有較好的相關性，血清miR－129和miR－1與血清ALT活性的相關性均很差。同時在慢性腎損傷模型中，外周血miR－122也只有輕微的變化，且血清miR－122在對乙酰氨基酚中毒患者和慢性腎損傷患者外周血中的表達水平有顯著性差異。進一步監測肝移植后的對乙酰氨基酚急性中毒患者血清miR－122的表達水平與ALT活性的改變，發現血清miR－122表達早于ALT達到正常的基線水平。

Zhang等[18]通過實時定量PCR技術檢測慢性乙肝患者外周血miR－122表達的變化，發現miR－122顯著升高，且與肝組織病理學變化程度和血清ALT峰值有很好的相關性。為了進一步證明miR－122作為肝損傷生物標志物的特異性，又比較了健康個體和僅肌肉損傷患者血漿miR－122差異，結果發現，肌肉損傷導致血清ALT活性升高7.8倍，而肌肉損傷患者外周血miR－122較正常組無顯著性變化。

由此可知，miR－122的表達水平與肝損傷程度密切相關，在藥物誘導的肝損傷模型中，miR－122發生特征性的改變，呈劑量依賴性且較傳統的肝損傷標志物血清轉氨酶特異性高。

3 循環miR－122生物標志物的靈敏性

目前，雖然尚不清楚miR－122在肝損傷病理過程中如何發揮作用，但動物實驗證實，循環miR－122在肝損傷早期就可以檢測到有顯著性升高，較傳統的肝毒性生物標志物靈敏。

Wang等[13]在對乙酰氨基酚誘導的肝損傷模型中發現，給藥后24 h，血漿中有44種miRNA的表達水平是對照組的2倍以上，其中25種顯著升高，而miR－122變化最顯著。為了檢測miR－122的靈敏性，他們在給予對乙酰氨基酚不同劑量后1和3 h檢測血漿miR－122和ALT的變化，兩者都呈現出劑量和時間依賴性，但對乙酰氨基酚過量暴露引起miR－122的變化更加明顯，而且在亞毒性劑量給藥后3 h和中毒劑量給藥后1 h，就可以檢測到血漿中miR－122的升高，血清轉氨酶卻無明顯變化。Laterza等[20]研究了CCl4和CBrCl3誘導的大鼠肝損傷模型中肝特異性miR－122在外周血中的變化。結果顯示，在組織病理學觀察到明顯的肝細胞凋亡和壞死時，與對照組相比，血漿miR－122升高的倍數較ALT升高倍數明顯。另外，在分析肝損傷模型組單個動物血漿miR－122和ALT變化與組織病理學結果相關性時，每只動物血漿miR－122的升高與肝細胞凋亡、壞死具有一致性，而血清ALT個體之間變化比較大，有些動物血清ALT只有輕微升高或明顯升高，而有些動物甚至檢測不到血清ALT的變化。

Yamaura等[19]在研究對乙酰氨基酚誘導SD大鼠肝損傷模型中，同樣證實了 miR－122在給藥后3 h開始升高，12 h達到峰值，而血清ALT在給藥后6 h開始升高，24 h達到峰值。在比較動物個體之間的差異時，miR－122的變異系數為8.21%，ALT的變異系數為 80.7%。因此，循環miR－122在動物個體之間的反應較血清ALT一致。

上述研究成果提示，外周血miR－122作為肝損傷潛在生物標志物較傳統的肝損傷評價標準血清轉氨酶更加靈敏，而且在動物個體之間的變化比較一致。

4 展望

循環miR－122因其在肝組織表達的特異、穩定和靈敏而有望成為肝毒性新的可靠的生物標志物。比起標準的ALT/AST測試，循環miR－122可以為早期肝損傷提供靈敏和特異性的指標。又因為miR－122在進化上的高度保守且已在臨床試驗中檢測到，因此，其在臨床前診斷結果可以為臨床試驗提供參考，而且循環miR－122生物標志物更易推向臨床實踐。

根據FDA和ICH分別頒布的關于新的生物標志物認證指導方案[42－43]，一個新的生物標志物的認證需要大量的研究數據支持。循環miR－122是否能夠代替傳統的肝毒性評價指標或者作為肝毒性評價的補充指標，尚需要更多更深入的研究來證明，比如必須明確循環miR－122表達與特定的藥物、具體的肝損傷機制或整體肝損傷的相關性，及其對肝損傷的預測及預后價值。更重要的是，需要闡明肝正常狀態下和被損傷時，循環 miR－122的來源和它與肝組織細胞miR－122的關系，從而為循環miR－122作為肝損傷藥物安全評價生物標志物提供更充分的證據。另外，血清轉氨酶之所以能成為目前肝損傷的標準檢測指標，還在于其臨床上快速、簡便的檢測方法。因此，研發循環miR－122更為精確、可行、方便和經濟的檢測方法顯得很有必要。

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