CYP3A4高表達肝細胞株建立及其對三氯乙烯毒性的影響

毛侃瑯，徐新云，何曉陽，毛吉炎，張 然，謝 杏，秦逍云

（1.深圳市疾病預防控制中心衛生毒理學重點實驗室／深圳市現代毒理學重點實驗室，廣東 深圳 518055；2.深圳大學生命科學學院細胞生物學實驗室／深圳市海洋生物資源與生態環境重點實驗室，廣東 深圳 518060）

工業上三氯乙烯常用于金屬的脫脂劑和脂肪、油及石蠟等的萃取劑，也用于冷凍劑、殺菌劑及衣服干洗劑等。近年來三氯乙烯引起部分接觸者嚴重的皮膚和肝損害甚至死亡的報道日益增多［1－3］。三氯乙烯接觸者的發病存在明顯的個體差異，這可能與不同個體通過肝代謝三氯乙烯后的產物不同有關。細胞色素P450酶（cytochro me P450，CYP）是一類重要的肝氧化代謝酶，很多藥物、環境毒物和職業毒物等都是通過CYP進行代謝。其中CYP3 A4占總CYP酶的30%～40%，參與多種環境污染物和藥物的代謝過程［4－5］。本實驗室在前期研究中發現，三氯乙烯可引起CYP3A4表達明顯改變，CYP3 A4可能在三氯乙烯代謝中起重要作用［3］。因此，本實驗通過慢病毒載體技術構建CYP3 A4高表達肝細胞株，并觀察其對三氯乙烯毒性的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑、質粒和細胞

限制性內切酶XmaⅠ和T4 DNA連接酶，購自美國Fer mentas公司；DNA膠回收試劑盒和RNeasy Mini試劑盒，購自德國Qiagen公司；Premix Pri me STAR HS、Ex Taq酶、Pri meScript RT試劑盒，SYBR Pri mescript RT－PCR試劑盒和核酸共沉劑，購自大連Ta Ka Ra公司；p GM－T載體和Top10感受態細菌，購自北京天根公司；質粒小量提取和無內毒素質粒小量提取試劑盒，購自美國OMEGA Bio－Tek公司；p LVX－ac GFP1－C1質粒（以下簡稱p LVX載體）和該質粒對應的慢病毒包裝試劑盒，購自美國Clontech公司；用于慢病毒包裝的293FT細胞，購自美國Invitr ogen公司；RPMI1640培養基和10%胎牛血清，購自美國Gibco公司；正常人L02肝細胞，購自中國上海細胞庫。CYP3 A4一抗購于美國Santa Cruz公司，兔抗小鼠二抗購于美國Ther mo Scientific公司。

1.2 CYP3A4 c DNA的擴增及其TA克隆載體構建

根據Gen Bank的CYP3 A4基因序列對所需引物進行設計，正向：CATCCCAGACTT－3′， 反 向：按照Premix Pri meSTAR HS的使用說明配置反應體系，以帶CYP3 A4基因的p Fast Bac－3 A4載體為模板進行PCR，退火溫度為62℃。PCR完成后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，然后用DNA膠回收試劑盒回收PCR產物，并再用Ex Taq酶進行加A尾反應。按照p GM－T載體的說明書，將加A尾產物與p GM－T載體連接，轉化Top10感受態細菌。常規篩選鑒定，挑取小量培養的PCR鑒定陽性克隆的細菌菌液，由上海生工測序。

1.3 慢病毒載體構建與包裝

挑取測序正確的重組T載體，先進行XmaⅠ酶切，用核酸共沉劑回收酶切產物后，再用XhoⅠ酶切。電泳鑒定后，用DNA膠回收試劑盒回收第二步的酶切產物，然后將其與經過相同處理的p LVX載體連接，轉化Top10感受態細菌。小量培養篩選出來的細菌，提取重組質粒進行PCR鑒定，并將菌液送至上海生工測序。挑取測序正確的重組p LVX載體，用p LVX載體對應的慢病毒包裝試劑盒將p LVX載體和包裝載體共轉染到293FT細胞中，37℃，5%CO2培養48 h后將上清培養基用0.45 μm濾膜過濾，收集病毒上清，用慢病毒包裝試劑盒內的Lenti－X GoStix金標試紙條對病毒的滴度進行測定，試紙條的C條帶和T條帶均出現，說明病毒滴度＞5×109IFU·L－1，足夠感染L02細胞。該病毒上清用于轉染L02肝細胞。

1.4 慢病毒轉染L02肝細胞

將L02細胞（約4×105個）接種于25 c m2的細胞培養瓶中，18 h后細胞融合度達到50%左右，取病毒上清2.5 ml，加入RPMI1640完全培養基2.5 ml（按1∶1稀釋），再加入聚凝膠至終濃度6～10 mg·L－1。去除培養瓶中的完全培養基，用PBS洗2次后加入上述含慢病毒的RPMI1640完全培養基。轉染24 h，去除含慢病毒的RPMI1640完全培養基，加入正常的RPMI1640完全培養基再培養24 h，用嘌羅霉素0.5 mg·L－1對細胞進行篩選，篩選時間為7 d。細胞培養條件是37℃，5%CO2，每2 d更換培養基。連續培養該細胞株20代再進行PCR和Wester n蛋白質印跡鑒定，細胞仍然穩定表達即作為CYP3 A4高表達肝細胞株。

1.5 CYP3A4高表達肝細胞株的鑒定

1.5.1 熒光定量PCR檢測CYP3A4基因mRNA

分別接種正常L02細胞和1.4所述重組慢病毒轉染并經嘌羅霉素7d處理后的存活細胞至6孔板（約1×105個），培養細胞約20 h至融合度80%。按照產品指南，用RNeasy Mini試劑盒提取細胞總RNA，用Pri meScript RT試劑盒將總RNA逆轉錄為c DNA。分別取正常細胞和高表達肝細胞的c DNA各1μl為模板進行熒光定量PCR，檢測CYP3 A4基因的表達量變化。以2－ΔΔCt表示目的基因的相對表達水平。

1.5.2 Wester n蛋白質印跡法檢測CYP3A4蛋白表達量

將正常L02細胞、CYP3 A4高表達肝細胞分別接種到兩個25 c m2的細胞培養瓶中（約1×106個）。培養約20 h，待細胞融合度達90%后去除培養基，吸棄細胞培養液，用冷PBS洗3次，加入細胞裂解液200μl，在冰上孵育3 min后用細胞刮將細胞快速刮下，收集到500μl管中，然后置于冰上繼續裂解20 min，16 000×g，4℃離心30 min，取上清，用BCA法測定蛋白質濃度，蛋白質上樣量30μg，最后加入5×SDS－PAGE 上樣緩沖液，100℃變性5 min。樣品隨后進行10%SDS－PAGE電泳分離，接著將蛋白電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉（TBST溶解）室溫封閉2 h。根據標志物和相對分子質量將膜上含GAPDH（37 ku）、CYP3 A4蛋白（58 ku）的部分分別切下，加入 CYP3A4一抗（1∶200），室溫孵育過夜。第2天用TBST洗膜3次（每次10 min），再加入兔抗小鼠二抗（1∶3000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次（每次10 min）后，加入Western蛋白質印跡實驗化學發光試劑光后用GE冷CCD成像系統對其進行曝光拍照，所得圖像用ImageJ軟件進行條帶灰度定量分析。以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.6 三氯乙烯處理CYP3A4高表達肝細胞

將正常L02肝細胞和CYP3A4高表達肝細胞分別接種到6孔板上，待細胞融合度達80%進行三氯乙烯染毒。三氯乙烯染毒濃度分別為0（溶劑對照），0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1。染毒12 h，將6孔板中的染毒液去除干凈，用PBS清洗細胞2次。提取細胞總RNA，用分光光度計（A260nm／A280nm）測定RNA濃度，逆轉錄后進行熒光定量PCR。

1.7 實時熒光定量PCR檢測CYP3A4高表達肝細胞中各凋亡基因和癌基因mRNA表達水平

提取1.6所述細胞總RNA，按照Ta Ka Ra的Pri me ScriptTMRT試劑盒配制逆轉錄反應體系20μl：5×Pri meScript?緩沖液4μl，Pri meScript?RT Enzy me Mix I 1.0μl，1.0μl Oligo d T 引物50μmol·L－1，Rando m 6 mers（100μmol·L－1）1.0μl，總RNA 1μg，加水至20μl。37℃15 min，85℃5 s，4℃10 min，進行逆轉錄。－20℃冰箱保存逆轉錄樣品。

基因的PCR引物由Ta Ka Ra生物公司合成（表1）。實時熒光定量PCR反應按照試劑盒說明書配制PCR反應體系20μl：SYBR?Pre mix Ex Taq T M （2×）10μl，PCR引物（10μmol·L－1）0.4μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，c DNA 模板 1 μl，d H2O 7.8μl。凋亡基因（bcl－2，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9）實時熒光定量PCR反應條件如下：95℃預變性5 s，1個循環；接著95℃變性5 s，58℃退火延伸30 s，共40個循環；癌基因（c－fos、c－myc、k－ras和 p53）的 PCR 反應條件為：95℃預變性5 s，1個循環；接著95℃變性5 s，54℃退火延伸30 s，共40個循環。

Tab.1 RT fluorescent quantitative PCR pri mers of target genes

以GAPDH的Ct值為內參，目的基因Ct值采用2－△△Ct法計算各基因的相對表達量，此步驟由ABI 7900 HT分析軟件自動計算并直接給出結果。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 CYP3A4慢病毒重組載體構建與病毒包裝鑒定

應用瓊脂糖凝膠電泳分析CYP3A4基因的PCR擴增產物，可見非常明顯條帶，大小約1500 bp，與預期相符。將含PCR產物的重組p GMT載體經上海生工測序，與Gen Bank上該基因的序列完全相符。將該片段從T載體上切下，與p LVX載體連接后進行測序，也與預期完全相符。

2.2 CYP3A4高表達肝細胞株中CYP3A4基因的表達

將正常L02細胞的CYP3 A4基因表達量作為對照，數值設為1，CYP3 A4高表達肝細胞的CYP3 A4基因表達量比正常L02細胞提高94倍。

2.3 CYP3A4高表達肝細胞株中的CYP3A4蛋白表達水平

以GAPDH蛋白為內參，檢測正常L02細胞和CYP3 A4高表達肝細胞CYP3A4蛋白表達水平，經歸一化處理后的灰度分析結果顯示（圖1），高表達肝細胞CYP3 A4蛋白含量是正常L02肝細胞的2.36倍。

Fig.1 CYP3A4 protein expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes detected by Wester n blotting.Lane 1：L02 cells；lane 2：blank control；lane 3：CYP3 A4 overexpressed hepatocytes.±s，n＝3.＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells.

2.4 三氯乙烯對CYP3A4高表達肝細胞中凋亡基因mRNA表達的影響

如圖2所示，與正常L02細胞相比，三氯乙烯0.25和0.5 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細胞中的bcl－2 mRNA表達水平明顯升高（P＜0.01），但隨著三氯乙烯劑量的升高與正常細胞無明顯差異。與正常肝細胞相比，三氯乙烯0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細胞中胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表達 都 顯 著 升 高 （P＜0.05）， 但 三 氯 乙 烯0.25 mmol·L－1雖使胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA的表達有所升高，但與正常對照組無顯著差異。

Fig.2 Effect of trichloroethylene on apoptosis gene expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes.The cells were treated wit h TCE f or 12 h.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells at t he sa me trichloroet hylene concentration.

2.5 三氯乙烯對CYP3A4高表達肝細胞癌基因mRNA表達的影響

與凋亡基因轉錄水平變化類似，三氯乙烯對CYP3 A4高表達肝細胞的癌基因轉錄亦產生明顯影響。與正常肝細胞相比，三氯乙烯0.25，0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使k－ras基因 mRNA 表達明顯升高（P＜0.05），p53 mRNA 表達明顯下降（P＜0.05）；三氯乙烯0.5，1.0，2.0和4.0 mmol·L－1使CYP3 A4高表達肝細胞中的c－f os和c－myc基因的mRNA表達明顯升高（P＜0.05），但三氯乙烯0.25 mmol·L－1處理無顯著變化（圖3）。

Fig.3 Effect of trichloroethylene on oncogene expression in CYP3A4 overexpressed hepatocytes.See Fig.2 f or cells treatment.±s，n＝3.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，co mpared wit h nor mal L02 cells at t he sa me trichlor oet hylene concentration.

3 討論

本實驗的實時熒光定量PCR和Wester n蛋白質印跡結果表明，CYP3 A4高表達載體構建非常成功，可以應用到三氯乙烯毒性研究中。

本實驗結果顯示，CYP3 A4高表達肝細胞中抗凋亡基因bcl－2的表達水平隨三氯乙烯濃度增加而降低，胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9基因表達水平則隨三氯乙烯濃度增加而升高。bcl－2在細胞凋亡的調控中起重要作用，其表達可以起到抑制細胞凋亡的作用，從而使細胞的存活率提高，因此，bcl－2基因表達水平下降預示著細胞凋亡水平的增高。本研究結果顯示，當三氯乙烯染毒劑量增至中等劑量以上時，CYP3 A4高表達肝細胞和正常肝細胞bcl－2表達水平基本接近，而CYP3 A4高表達肝細胞胱天蛋白酶3、胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9的mRNA表達水平顯著高于正常肝細胞，說明低劑量三氯乙烯可以促進CYP3 A4高表達肝細胞中的抗凋亡基因bcl－2表達，而高劑量時主要是促進胱天蛋白酶3，胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9基因的表達，推測其原因可能是三氯乙烯在CYP3 A4高表達肝細胞中具有促進凋亡基因活化的作用。胱天蛋白酶是一組在凋亡中發揮起始和執行作用的蛋白［6］，其中胱天蛋白酶3是最重要的凋亡執行者之一，是凋亡的主要效應因子，其活化意味著凋亡進入不可逆階段［7］。胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶9則是凋亡的啟動因子，在自我活化后能激活凋亡執行。因此，4種凋亡基因表達水平的變化表明，三氯乙烯染毒對CYP3 A4高表達肝細胞凋亡基因有明顯影響，并且與正常肝細胞相比，三氯乙烯引起對CYP3 A4高表達肝細胞的細胞凋亡有明顯促進作用，是三氯乙烯在肝細胞代謝中的重要因素之一。

三氯乙烯染毒CYP3 A4高表達肝細胞后癌基因c－f os，c－myc和k－ras表達水平隨三氯乙烯濃度增加而升高，p53表達水平隨三氯乙烯濃度增加而降低。c－fos，c－myc和k－ras基因均為編碼關鍵性調控蛋白的正常細胞基因，c－myc和c－fos參與了胞外生長信號轉導至基因水平的過程，在調控細胞分裂的過程中是否從G0期轉向G1期中起重要作用［8］；而kras則作為一個“分子開關”起作用［9］，一旦其處于“開啟”狀態，就會招募并激活傳播生長因子和其他受體信號所必需的蛋白。當受到理化等因素作用而活化時，這些基因表達異常，可導致細胞的增殖、分化或癌變，k－ras屬于原癌基因。p53基因的主要功能是維持細胞基因組的穩定，是一種抑癌基因。

目前，動物實驗已經證明三氯乙烯具有致癌性［10－12］，由于當時人群流行病學資料不足，國際癌癥研究機構（IARC）于1995年將三氯乙烯定為“對人類可能致癌物”［13］。2011年9月，IARC在進行了充分的資料收集，之后美國環保署發布了針對三氯乙烯的最終健康風險評估報告，將其確認為致癌物質，并且還指出了其對人類的中樞神經系統、腎、肝、男性生殖系統以及胎兒發育都有一定的危害［14］。本實驗結果顯示，三氯乙烯具有明顯的促進癌基因表達的生物學作用，而且CYP3 A4高表達肝細胞比正常肝細胞的癌基因表達水平更高，提示三氯乙烯可能經過肝代謝酶活化，增加了三氯乙烯對癌基因的活化水平，為深入研究三氯乙烯的致癌作用提供了理論依據。

［1］Xu XY，Wu PQ，Ke YB，Zhou L，He C，Yuan JH，et al.Oxidative stress and inducible nitric oxide synt hase expression in hu man hepatocytes treated wit h trichlor oet hylene［J］.Toxicol Envir on Chem，2010，92（4）：801－811.

［2］Xu X，Yang R，Wu N，Zhong P，Ke Y，Zhou L，et al.Severe hypersensitivity der matitis and liver dysf unction induced by occupational exposure to trichloroethylene［J］.Ind Health，2009，47（2）：107－112.

［3］Xu XY，Liu YF，Ke YB，Mao JY，Yuan JH，Zhou L，et al.mRNA Expression of hepatic metabolic enzy me genes and apoptosis genes in L02 cells treated wit h trichloroet hylene［J］.Carcinog Terat og Mutag（癌變.畸變.突變），2011，23（5）：349－352.

［4］Jiang M，Xiong YQ.The cytochr o me P450 3 A4 and dr ug metabolis m［J］.Pract Clin Med（實用臨床醫學），2006，7（11）：199－201，204.

［5］Rendic S.Summary of inf or mation on hu man CYP enzy mes：hu man P450 metabolis m data［J］.Dr ug Metab Rev，2002，34（1－2）：83－448.

［6］Fulda S.Caspase－8 in cancer biology and t herapy［J］.Cancer Lett，2009，281（2）：128－133.

［7］Sharifi A M，Esla mi H，Larijani B，Davoodi J.Involvement of caspase－8，－9，and－3 in high gl ucose－induced apoptosis in PC12 cells［J］.Neur osci Lett，2009，459（2）：47－51.

［8］Vamvakas S，Bittner D，K?ster U.Enhanced expression of t he pr ot ooncogenes c－myc and c－f os in nor mal and malignant renal growt h［J］.Toxicol Lett，1993，67（1－3）：161－172.

［9］Friday BB，Adjei AA.K－ras As a target f or cancer therapy［J］.Biochi m Biophys Acta，2005，1756（2）：127－144.

［10］Elfarra AA，Krause RJ，Last AR，Lash LH，Par ker JC.Species－and sex－related differences in metabolis m of trichlor oet hylene to yield chloral and trichloroet hanol in mouse，rat，and hu man liver microso mes［J］.Dr ug Metab Dispos，1998，26（8）：779－785.

［11］Brüning T，Bolt H M.Renal t oxicity and carcinogenicity oftrichloroet hylene：key results，mechanis ms，and controversies［J］.Crit Rev Toxicol，2000，30（3）：253－285.

［12］Bull RJ.Mode of action of liver tu mor induction by trichlor oet hylene and its metabolites，trichlor oacetate and dichlor oacetate［J］.Environ Health Perspect，2000，108（Suppl 2）：241－259.

［13］Stewart BW.Trichlor oet hylene and cancer：a carcinogen on trial［J］.Med J Aust，2001，174（5）：244－247.

［14］USEPA.EPA Releases Final Healt h Assessment f or TCE［OE／BL］. （2011－09－28） htt p：／／www.yose mite.epa.gov／opa／ad mpress.nsf／03dd877d6f1726c28525735900404443／b8d0e4d8489ad991852579190058d6c3