金納米粒子對CHO-K1細胞毒性的谷胱甘肽作用機制

李武珊，陳麗君

(山東大學齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東濟南 250012)

納米材料和納米技術(shù)在生物醫(yī)學領域的應用是目前研究的熱點，金納米粒子(納米金，gold nanoparticles，AuNP)通常指直徑為1～100 nm 的金顆粒，AuNP在水中因為靜電作用可形成穩(wěn)定存在的膠體狀態(tài)，因此也稱膠體金(gold colloids)。AuNP具有表面積大，易被活性基團修飾和吸收紅外線而發(fā)熱等物理和化學特點，金納米粒子不僅在電子、催化等科技領域廣泛應用，而且被越來越多地應用于生物檢測、醫(yī)學成像、藥物和基因運輸以及腫瘤治療等生物醫(yī)學研究領域[1－5]。如抗原抗體反應中以AuNP作為標記物，可應用于免疫學、病理學和細胞生物學的診斷和檢測[1，6];在腫瘤診斷和治療方面，靶向標記的AuNP可用于細胞成像，明顯提高腫瘤檢測的靈敏度[7－8];AuNP可以增強腫瘤細胞對放療的敏感性[9－10];AuNP吸收紅外線而產(chǎn)熱的特點被用于腫瘤的光熱療法，采用紅外照AuNP可升高特定部位細胞的溫度而發(fā)揮殺腫瘤細胞作用[11];AuNP可以裝載抗腫瘤藥物，紅外線照射可控制釋放藥物[12－14];表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)抗體、葡萄糖和葉酸修飾的AuNP可靶向結(jié)合于腫瘤細胞，為腫瘤的靶向治療提供新的思路和方法[9，15－16]。

隨著AuNP在生物醫(yī)學領域的廣泛應用，需要系統(tǒng)地評價AuNP的生物安全性，因此，眾多研究者致力于研究AuNP對細胞和動物的毒性，但是目前研究結(jié)果不一致，通常認為AuNP的毒性與其顆粒大小、形狀、表面修飾物以及實驗細胞類別有關[1，17－18]。如體外細胞實驗中，AuNP 對白血病細胞和小鼠巨噬細胞沒有體現(xiàn)出毒性[19－20]，而在人肺成纖維細胞實驗中發(fā)現(xiàn)，AuNP可引起細胞的氧化應激和自我吞噬反應[21]，1.4 nm的AuNP可引起宮頸癌細胞壞死，而15 nm的AuNP對宮頸癌細胞幾乎沒有細胞毒性[22]。動物實驗中，一般認為AuNP的生物兼容性比較好，靜脈注射的AuNP可以被有效地排出體外[1]，但是也有研究發(fā)現(xiàn)AuNP可引起肝急性炎癥[23]。另有研究發(fā)現(xiàn)，采用灌胃給予AuNP比靜脈注射引起的毒性大，可明顯引起動物體質(zhì)量減輕等不良反應[24]。文獻對金納米粒子的生物毒性研究，多停留在表面現(xiàn)象的觀察上，對于其作用機制知之甚少，AuNP進入細胞后，細胞中何種物質(zhì)做出主要反應，尚缺乏有力的實驗數(shù)據(jù)。谷胱甘肽(glutathione，GSH)是哺乳動物細胞和組織中表達的一種三肽類化合物，在肝中表達最為豐富，GSH在細胞和機體內(nèi)功能之一是解毒，如清除活性氧和解毒重金屬化合物，從而保護機體免受環(huán)境中一些致病因子的損傷[25－27]。AuNP由金原子組成，GSH是否對AuNP誘導的細胞損傷具有保護作用值得探討。

本研究采用中國倉鼠卵巢細胞系CHO-K1研究直徑為13 nm的AuNP的毒性作用和GSH對細胞的保護作用，為下一步動物實驗及臨床評價提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器

中國倉鼠卵巢細胞系CHO-K1，購自中國科學院細胞庫。F12K培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，AnnexinⅤ-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司，丁硫氨酸-亞砜亞胺(L-buthionine-sulfoximine，BSO)、還原型 GSH，TRITC-鬼筆環(huán)肽(TRITC-phalloidin)購自美國Sigma公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒、GSH檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司，直徑13 nm的AuNP由山東大學化學院丁軼課題組提供。倒置顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品，流式細胞儀為美國BD公司產(chǎn)品，激光掃描共聚焦顯微鏡為德國Zeiss公司產(chǎn)品。

1.2 細胞培養(yǎng)

含 10%胎牛血清、谷氨酰胺 2 mmol·L－1、青霉素100 kU·L－1、鏈霉素 100 mg·L－1的 F12K 培養(yǎng)基，培養(yǎng)環(huán)境為37℃培養(yǎng)箱，飽和濕度，5%CO2，0.25%胰酶-0.02%EDTA消化傳代細胞。

1.3 MTT 法檢測細胞存活率[28]

細胞接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，加入含有 AuNP 10，20，50 和 100 μmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，加入MTT母液，使MTT濃度為0.5 g·L－1，37℃中孵育 3～4 h，棄去原培養(yǎng)基，加入200 μl DMSO，混勻，酶標儀下檢測570 nm處的吸光度(A570nm)，以對照組為參考，計算各組存活率。存活率(%)=(A實驗組/A對照組)×100%。

1.4 倒置顯微鏡下觀察CHO-K1細胞形態(tài)

細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，按照分組，分別加入含有 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmol·L－1和 AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng)72 h，將細胞培養(yǎng)板放到倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 TRITC-鬼筆環(huán)肽標記共聚焦顯微鏡檢測細胞微絲[29]

將細胞接種于無菌蓋玻片上(在培養(yǎng)皿中)，培養(yǎng)過夜，加入分別含 AuNP 10 μmol·L－1，BSO 20 μmo·lL－1，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH 1 mmol·L－1的培養(yǎng)基，培養(yǎng) 48 h，PBS 洗 2 次，4%多聚甲醛固定，PBS洗2次，0.1%Triton X-100孵育5 min，用含有1%BSA的PBS緩沖液洗滌2次，室溫下孵育60 min封閉非特異吸附，加入TRITC標記的鬼筆環(huán)肽室溫染色30 min，含1%BSA的PBS緩沖液洗滌3次，共聚焦顯微鏡觀察，與空白對照組進行比較。

1.6 AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細胞儀分析細胞凋亡率[28]

接種細胞于六孔板中，培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，加入分別含有AuNP，BSO，AuNP+BSO和AuNP+BSO+GSH的培養(yǎng)基，72 h后經(jīng)胰酶-EDTA消化，取細胞PBS洗2次，然后使用AnnexinⅤ-FITC凋亡試劑盒進行染色，具體步驟按照試劑盒說明書操作，染色結(jié)束后，流式細胞儀檢測AnnexinⅤ-FITC和PI陽性的比例，計算細胞凋亡的百分比，各組進行比較。

1.7 JC-1標記流式細胞儀分析細胞線粒體膜電位[29]

接種細胞于 6孔板，培養(yǎng)過夜，加入含有AuNP，BSO，AuNP+BSO 和 AuNP+BSO+GSH的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集細胞，JC-1染色，37℃20 min，PBS洗滌2次，流式細胞儀分析紅光和綠光強度，膜電位正常時，產(chǎn)生紅色熒光，膜電位破壞時，產(chǎn)生綠色熒光，綠光強度與紅光強度的比值可以反映線粒體膜電位的破壞情況。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 金納米粒子對CHO-K1細胞存活的影響

表1 結(jié)果所示，AuNP 10，20，50 和100 μmol·L－1對卵巢細胞CHO-K1存活率無明顯影響。

Tab.1 Effect of gold nanoparticles(AuNP)on CHO-K1 cell survival rate

2.2 AuNP對低GSH水平CHO-K1細胞存活的影響

表2結(jié)果所示，與正常對照組相比，單獨AuNP 10 μmo·lL－1或BSO 20 μmo·lL－1對CHO-K1細胞存活無明顯影響，兩者聯(lián)合處理細胞，能夠明顯抑制CHO-K1細胞存活，抑制率(82±2)%(P＜0.01)，說明細胞GSH水平被BSO抑制后，AuNP會對細胞產(chǎn)生毒性作用;若同時再加入外源性的 GSH 1 mmo·lL－1，細胞存活恢復至正常對照組水平。

Tab.2 Effect of AuNP on cell surival of CHO-K1 with low GSH level

2.3 AuNP對低GSH水平CHO-K1細胞形態(tài)影響

圖1結(jié)果所示，與正常對照組相比(圖1A)，單獨AuNP 10 μmol·L－1(圖1B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖1C)對CHO-K1細胞形態(tài)無明顯影響，兩者聯(lián)合處理細胞，細胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，胞體皺縮，變圓(圖1D);若同時再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，細胞形態(tài)恢復至正常對照組水平(圖1E)。

2.4 AuNP對低GSH水平CHO-K1細胞微絲結(jié)構(gòu)的影響

圖2結(jié)果所示，與正常對照組相比(圖2A)，單獨AuNP 10 μmol·L－1(圖2B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖2C)對CHO-K1細胞微絲結(jié)構(gòu)無明顯影響，兩者聯(lián)合處理細胞，細胞微絲結(jié)構(gòu)被明顯破壞(圖2D);若同時再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，細胞微絲結(jié)構(gòu)恢復至正常對照組水平(圖2E)。

2.5 AuNP對低GSH水平CHO-K1細胞凋亡的影響

圖3結(jié)果所示，與正常對照組相比(圖3A)，單獨AuNP 10 μmol·L－1(圖3B)或 BSO 20 μmol·L－1(圖3C)不能誘導CHO-K1細胞凋亡，兩者聯(lián)合處理細胞，細胞凋亡率明顯增加，凋亡率為(65.7±5.8)%(圖3D，n=3，P＜0.01);若同時再加入外源性的GSH 1 mmol·L－1，細胞凋亡率恢復至正常對照組水平，凋亡率為(4.3±0.7)%(圖3E)。正常對照組凋亡率為(3.11±0.31)%，AuNP和BSO單獨處理的細胞凋亡率分別為(3.4±0.5)%和(4.1±0.6)%，與正常對照組無顯著差異。

Fig.1 Effect of AuNP on morphology of CHO-K1 cells with low GSH level.The cells were treated with drugs for 72 h.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L－1group;C:BSO 20 μmol·L－1group;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1group;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1group.

Fig.2 Effect of AuNP on microfilament of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L－1;D:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1;E:AuNP 10 μmol·L－1+BSO 20 μmol·L－1+GSH 1 mmol·L－1.The representative fields were photographed at 630×(oil)magnification by confocal laser scanning microscopy.

Fig.3 Effect of AuNP on apoptosis of CHO-K1 cells with low GSH level.A:normal control;B:AuNP 10 μmol·L －1;C:BSO 20 μmol·L －1;D:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1;E:AuNP 10 μmol·L －1+BSO 20 μmol·L －1+GSH 1 mmol·L －1 .

2.6 AuNP對低GSH水平CHO-K1細胞線粒體膜電位的影響

表3結(jié)果所示，與正常對照組相比，單獨AuNP 10 μmol·L－1或BSO 20 μmol·L－1對CHO-K1細胞線粒體膜電位無明顯影響，兩者聯(lián)合處理細胞，細胞線粒體膜電位發(fā)生明顯破壞(綠光/紅光比值明顯增大);若同時再加入外源性的 GSH 1 mmol·L－1，細胞線粒體膜電位恢復至正常對照組水平。

Tab.3 Effect of AuNP on mitochondrial membrane potential of CHO-K1 cells with low GSH level

3 討論

本研究結(jié)果顯示，AuNP 濃度達到100 μmol·L－1對正常的卵巢細胞CHO-K1無明顯的細胞毒性，與文獻報道的良好生物兼容性一致[1，19－20]。但 AuNP的化學成分是重金屬金，毒性體現(xiàn)不出來有兩種可能，一是對細胞無毒，另外一種可能是細胞中的相應物質(zhì)可以解除AuNP的毒性。文獻報道GSH可能是解除AuNP毒性的關鍵物質(zhì)[25－27]。本研究結(jié)果顯示，當CHO-K1細胞GSH含量被BSO抑制后，AuNP使細胞存活率明顯降低，細胞形態(tài)發(fā)生改變，微絲結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細胞發(fā)生凋亡;補充外源性的GSH后，細胞存活率和細胞形態(tài)恢復，細胞無明顯凋亡，與正常對照組細胞無顯著差異，結(jié)果提示GSH是細胞應對AuNP毒性的重要物質(zhì)。

AuNP的化學組成為金，鉑類化合物可以損傷線粒體誘導細胞凋亡[31]，金與鉑同為重金屬化合物，有可能會對線粒體產(chǎn)生一定的損傷，本實驗結(jié)果顯示，AuNP可能通過線粒體損傷誘導低表達GSH的細胞凋亡。

本研究結(jié)果提示，AuNP的生物相容性是有條件的，即細胞需要有足夠的GSH來對抗AuNP的毒性，如果因為藥物和病理原因?qū)е录毎蜋C體缺乏GSH，會出現(xiàn)AuNP的毒性。因此，要謹慎對待AuNP的生物醫(yī)學特性。

[1]Li YF，Chen C.Fate and toxicity of metallic and metal-containing nanoparticles forbiomedicalapplications[J].Small，2011，7(21):2965-2980.

[2]Arvizo RR，Bhattacharyya S，Kudgus RA，Giri K，Bhattacharya R，Mukherjee P.Intrinsic therapeutic applications of noble metal nanoparticles:past，present and future[J].Chem Soc Rev，2012，41(7):2943-2970.

[3]Jain KK.Advances in the field of nanooncology[J].BMC Med，2010，8:83.

[4]Minelli C，Lowe SB，Stevens MM.Engineering nanocomposite materials for cancer therapy[J].Small，2010，6(21):2336-2357.

[5]Liu WJ，Gu XH，Ding Y，Zhang XM，Zhao YX.Application of gold nanoparticles in anticancer research[J].Prog Mod Biomed(現(xiàn)代生物醫(yī)學進展)，2010，10(5):982-985.

[6]Xie ZX，Guo J.Performance evaluation of HCV antibody detection by bi-directional lateral flow method[J].Chin J Lab Med(中華檢驗醫(yī)學雜志)，2007，30(5):538-540.

[7]Mallidi S， Larson T， Tam J， Joshi PP，Karpiouk A，Sokolov K，et al.Multiwavelength photoacoustic imaging and plasmon resonance coupling of gold nanoparticles for selective detection of cancer[J].Nano Lett，2009，9(8):2825-2831.

[8]Yang J，Eom K，Lim EK，Park J，Kang Y，Yoon DS，et al.In situ detection of live cancer cells by using bioprobes based on Au nanoparticles[J].Langmuir，2008，24(21):12112-12115.

[9]Li X，Zhou H，Yang L，Du G，Pai-Panandiker AS，Huang X，et al.Enhancement of cell recognition in vitro by dualligand cancer targeting gold nanoparticles[J].Biomaterials，2011，32(10):2540-2545.

[10]Chattopadhyay N，Cai Z，Pignol JP，Keller B，Lechtman E，Bendayan R，et al.Design and characterization of HER-2-targeted gold nanoparticles for enhanced X-radiation treatment of locally advanced breast cancer[J].Mol Pharm，2010，7(6):2194-2206.

[11]Melancon MP， Lu W， Yang Z， Zhang R，Cheng Z，Elliot AM，et al.In vitro and in vivo targeting of hollow gold nanoshells directed at epidermal growth factor receptor for photothermal ablation therapy[J].Mol Cancer Ther，2008，7(6):1730-1739.

[12]You J， Zhang G， Li C. Exceptionally high payload of doxorubicin in hollow gold nanospheres for near-infrared light-triggered drug release[J].ACS Nano，2010，4(2):1033-1041.

[13]Yavuz MS，Cheng Y，Chen J，Cobley CM，Zhang Q，Rycenga M，et al.Gold nanocages covered by smart polymers for controlled release with near-infrared light[J].Nat Mater，2009，8(12):935-939.

[14]Jin Y，Gao X.Spectrally tunable leakage-free gold nanocontainers[J].J Am Chem Soc，2009，131(49):17774-17776.

[15]Huang X，Jain PK，El-Sayed IH，El-Sayed MA.Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles[J].Photochem Photobiol，2006，82(2):412-417.

[16]Glazer ES，Zhu C，Massey KL，Thompson CS，Kaluarachchi WD，Hamir AN，et al.Noninvasive radiofrequency field destruction of pancreatic adenocarcinoma xenografts treated with targeted gold nanoparticles[J].Clin Cancer Res，2010，16(23):5712-5721.

[17]Khlebtsov N，Dykman L.Biodistribution and toxicity of engineered gold nanoparticles:a review of in vitro and in vivo studies[J].Chem Soc Rev，2011，40(3):1647-1671.

[18]Qiu Y，Liu Y，Wang L，Xu L，Bai R，Ji Y，et al.Surface chemistry and aspect ratio mediated cellular uptake of Au nanorods[J].Biomaterials，2010，31(30):7606-7619.

[19]Connor EE，Mwamuka J，Gole A，Murphy CJ，Wyatt MD.Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity[J].Small，2005，1(3):325-327.

[20]Zhang Q，Hitchins VM，Schrand AM，Hussain SM，Goering PL.Uptake of gold nanoparticles in murine macrophage cells without cytotoxicity or production of pro-inflammatory mediators[J].Nanotoxicology，2011，5(3):284-295.

[21]Li JJ，Hartono D，Ong CN，Bay BH，Yung LY.Autophagy and oxidative stress associated with gold nanoparticles[J].Biomaterials，2010，31(23):5996-6003.

[22]Pan Y，Leifert A，Ruau D，Neuss S，Bornemann J，Schmid G，et al.Gold nanoparticles of diameter 1.4 nm trigger necrosis by oxidative stress and mitochondrial damage[J].Small，2009，5(18):2067-2076.

[23]Cho WS，Cho M，Jeong J，Choi M，Cho HY，Han BS，et al.Acute toxicity and pharmacokinetics of 13 nm-sized PEG-coated gold nanoparticles[J].Toxicol Appl Pharmacol，2009，236(1):16-24.

[24]Zhang XD， Wu HY， Wu D， Wang YY，Chang JH，Zhai ZB，et al.Toxicologic effects of gold nanoparticles in vivo by different administration routes[J].Int J Nanomed，2010，5:771-781.

[25]Yang P，Ebbert JO，Sun Z，Weinshilboum RM.Role of the glutathione metabolic pathway in lung cancer treatment and prognosis:a review[J].J Clin Oncol，2006，24(11):1761-1769.

[26]Wang YM，Peng SQ，Han G，Dong YS.Role of mitochondrial permeability transition in cytotoxicity of butenolide[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2008，22(2):136－139.

[27]Diehn M，Cho RW，Lobo NA，Kalisky T，Dorie MJ，Kulp AN，et al.Association of reactive oxygen species levels and radioresistance in cancer stem cells[J].Nature，2009，458(7239):780-783.

[28]Liu Y，Bao QQ，Zhuang XS，Hu Q，Sun MX，Zhou LL，et al.Protective effect of catalpol on lactacysin-induced injury in SH-SY5Y cells[J].Chin J Pharmacol Toxicol(中國藥理學與毒理學雜志)，2012，26(1):58-62.

[29]Zhao Y，Liu W，Zhou Y，Zhang X，Murphy PV.N-(8-(3-ethynylphenoxy)octyl-1-deoxynojirimycin suppresses growth and migration of human lung cancer cells[J].Bioorg Med Chem Lett，2010，20(24):7540-7543.

[30]Franklin-Tong VE，Gourlay CW.A role for actin in regulating apoptosis/programmed cell death:evidence spanning yeast，plants and animals[J].Biochem J，2008，413(3):389-404.

[31]Feng LP，Qiao W.Mechanism of programmed cell death of renal proximal tubular cells induced by cisplatin[J].J Jilin Univ(Med Ed)〔吉林大學學報(醫(yī)學版)〕，2008，34(4):581-584.