結直腸癌早期診斷的研究進展＊

劉嫩容，汪 躍，廖發電，黃少華，陳 榮

(醫學光電科學與技術教育部重點實驗室，福建師范大學，福建 福州 350007)

0 引言

癌癥仍是當今世界人類健康面臨的最大挑戰，我國近20年來癌癥呈現年輕化及發病率和死亡率“三線”走高的趨勢。全國腫瘤登記中心發布《2012中國腫瘤登記年報》顯示:我國每分鐘就有6人確診為癌癥，其中結直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)發病率居第3位，占癌癥死因第4位。結直腸癌是一種可以預防、早診早治的惡性腫瘤，“三早”(早期發現，早期診斷，早期治療)是提高結直腸癌治療效果的最有效方法。臨床資料顯示:早期癌癥病人術后5年存活率高達90%以上［1］。然而，由于結直腸癌早期無明顯癥狀且缺乏高靈敏度和強特異性的早期診斷技術，大部分患者確診時已是癌癥晚期，失去了最佳治療時機，導致術后5年存活率很低(低于20%)。再者，由于缺乏對結直腸癌變產生發展機制及治療預后響應機制的準確認識，目前結直腸癌的病因尚不明確。流行病學調查結果顯示結直腸癌的發生可能與遺傳因素、飲食因素、慢性炎癥、病毒感染、環境以及免疫功能失常等因素密切有關。因此，探索結直腸癌的產生發展機制以及建立早期結直腸癌無損快速診斷及治療評估方法已經成為當前醫學界重點攻關難題。

本文首先簡要介紹了結直腸組織微結構和癌變進程，總結了現有臨床診斷方法及其不足，著重探討了非線性光譜技術在結直腸癌早期診斷中的最新進展。

1 結直腸組織微結構

正常結直腸組織是層狀上皮結構，主要分為四層:粘膜層、粘膜下層、肌層和外膜，粘膜層又分為:1)上皮 (epithelium):單層柱狀上皮，有柱狀細胞和杯狀細胞。直腸齒狀線以上與結腸相似，為單層柱狀上皮，齒狀線與痔環之間為未角化的復層扁平上皮，痔環以下為角化的復層扁平上皮。2)固有層(lamina propria):為疏松結締組織，細胞成分較多，纖維較細密，有豐富的毛細血管和毛細淋巴管，有長單管狀的大腸腺，無潘氏細胞，有孤立淋巴小結。3)粘膜肌層 (muscularis mucosa):為薄層平滑肌，其收縮可促進固有層內的腺體分泌物排出和血液運行，利于物質吸收和轉運。粘膜下層主要富含疏松結締組織，有成群脂肪細胞。肌層結構特征為內環外縱，外縱行肌局部增厚形成三條結腸帶。結腸外膜除升、降結腸后壁為纖維膜，其余均為漿膜。直腸外膜上1/3段和中1/3段的前壁為漿膜，其余為纖維膜［2］。結直腸組織層狀結構如圖1所示［3］。

圖1 正常結直腸組織層狀結構示意圖［3］Fig.1 Layered microstructure schematic diagram of normal colorectal tissue

2 結直腸組織癌變進程

任何癌的產生都會出現細胞或組織的異型性，病理學上用“異型增生”表述腫瘤細胞或組織形態變化，將出現異型增生而未出現侵襲行為的統稱為癌前病變。腫瘤細胞侵襲行為是判斷癌前病變和癌變的關鍵，因此正確判斷異型細胞是否發生浸潤在病理診斷上非常重要。由于各種器官組織的特性不同，腫瘤細胞出現侵襲行為判斷為癌的標準也不同。結直腸癌細胞侵襲的標志主要是觀察基底膜和粘膜肌層的突破。粘膜內腺體完整性破壞則提示基底膜突破，瘤細胞侵襲局限在基底膜在粘膜內浸潤稱為粘膜內癌，瘤細胞浸潤到粘膜下層則提示粘膜肌層突破，稱為粘膜下層癌。習慣上，將粘膜內癌和粘膜下層癌統稱為早期癌。瘤細胞若突破粘膜下層則為進展型癌，特別指出，結直腸癌變中95% 以上是腺癌［4-5］。圖2 所示為腺瘤癌變途徑示意圖［6］。

3 結直腸癌臨床診斷方法

近20年，結直腸癌在診斷方面取得了很大進展，各種診斷方法不斷改進，新診斷方法和技術不斷涌現，對結直腸癌的早期診斷、定位和分期提高到了一個新的認知水平。

圖2 結直腸組織腺瘤癌變途徑示意圖［6］Fig.2 Canceration process schematic diagram of colorectal adenoma

3.1 腸道排泄物診斷法

大便隱血試驗(fcecal occult blood testing，FOBT)［7-8］是CRC常用的初篩方法，以腫瘤的伴隨癥狀--出血為檢測對象，具有操作簡便、無創等優點，但FOBT診斷的靈敏度和特異性差異較大，影響因素復雜。脫落癌細胞檢測方法通過檢測糞便內CRC脫落細胞的微量DNA，具有有較高的靈敏度和特異度，為結直腸癌的早期診斷開辟了新的途徑。但該方法分離過程繁瑣，易受細菌、食物及腸道黏液等干擾。糞便基因檢測(stool DNA testing，sDNA)［9-11］較 FOBT具有更高的靈敏度和特異性，人群依從性較好，但由于檢測位點多，成本高，限制了臨床應用。由于CRC發病的復雜性，目前尚未找到理想的診斷標志物。

3.2 結腸鏡診斷法

結腸鏡檢查是目前CRC最基本的診斷手段。通過放大結腸鏡能夠在活體情況下看到亞細胞結構，結合三維重建技術，可以判定病變的性質，其與活檢病理診斷的符合率高達95%［12］。聯合窄帶成像技術，無需染色即可獲得與內鏡下染色相同的視覺效果，可實現對早期CRC作出實時、準確的診斷［13］。CT虛擬結腸鏡利用計算機斷層掃描技術和三維圖像重構，可獲得與結腸鏡相似的進展期CRC檢出率，盡管其對早期結CRC和結直腸息肉的診斷不如結腸鏡檢查，而且影響因素眾多，對設備和技術的要求也很高，誤診率較高，但具有結腸鏡或鋇灌腸等無法比擬的優點，如檢查時間短、無創、無痛苦等。

3.3 影像學診斷法

影像學診斷在明確CRC的診斷、確定系統治療方案、選擇外科手術術式及監測預后等方面中，都發揮了重要的作用，受到越來越多臨床醫生的重視［14-16］。CRC的影像學診斷方法，包括:鋇劑灌腸(barium enemas，BE)、腔內超聲 (endoscopic ultrasound，EUS)、計算機體層攝影 (computed tomography，C T)、磁共振成像 (magnetic resonance imaging，MRI)和正電子發射體層攝影(positron emission tomography，PET)等。上述影像學方法各有優點和劣勢，目前醫生通過上述的一些技術手段很容易對中晚期癌癥做出臨床診斷。但是，鑒于上述方法受空間分辨率的限制(毫米量級)，無法獲得結直腸組織早期病變的微結構信息，尚無法實現早期CRC診斷。

4 激光共焦顯微成像技術

1990年激光共聚焦掃描技術的出現，共焦顯微鏡成為生物組織非侵入式顯微成像的有力工具，被廣泛用于皮膚、胃腸、角膜等組織微結構形態病理分析［17，18］，尤其是其與內窺鏡技術相結合，可實現活體組織實時高分辨顯微成像，引起人們廣泛關注［19-22］。共聚焦激光顯微內窺鏡系統能直接進入人體或動物模型的內部器官，無需取樣和組織病理學檢查即可實現高分辨率的實時組織學診斷和一定深度的斷層掃描成像。通過使用熒光對比劑，特異性強，操作簡單，避免了重復內鏡檢查和多次取樣，成為無創性診斷早期腫瘤及其癌前病變的重要方法。文獻［19］獲取了42例大腸病變患者的共聚焦顯微圖像，并據此做出判定，病理核實準確率達99.2%，診斷靈敏度和特異性分別為97.4%和99.4%。可以說激光共焦掃描內窺鏡為內部器官腫瘤的早期診斷產生了劃時代的意義，是當前CRC早期診斷的研究熱點之一。但是，激光共焦顯微鏡存在一個致命弱點，即穿透深度淺，成像深度僅局限于粘膜層，并且對生物組織具有光毒性和光漂泊作用。為了增加成像對比度往往使用熒光增強標記，增加了病人風險。因此，亟需開發一種能夠對結直腸癌組織微觀形態學和內在分子組分光譜學進行客觀無損地診斷和監測的高分辨率、高靈敏度的深度分辨光譜成像技術。

5 TPEF和SHG的非線性光譜成像技術

以飛秒激光與生物組織相互作用產生的雙光子激發熒光(two-photon excited fluorescence，TPEF)和二次諧波(second harmonic generation，SHG)等非線性光學效應作為信號源的多光子顯微成像技術(multipnoton microscopy，MPM)可以同時獲得組織內在成分的高靈敏度和高空間分辨率微結構成像和光譜特性，并具有“光切”功能、低殺傷性且成像深度深等特點，已被廣泛用于子宮、胃腸、食道、皮膚等生物醫學的各個領域，成為國際生物醫學光子學研究領域最前沿的課題［23-26］。胃腸等生物組織的許多內在成分無須外加標記即能產生較強的自體熒光和二次諧波信號，比如彈性蛋白、色氨酸、黃素蛋白 FAD、還原性輔酶 NADH、血管、卟啉及其衍生物能產生雙光子激發熒光;具有非中心對稱結構的膠原蛋白、肌肉、肌漿球蛋白等能產生二次諧波信號。因此，多光子顯微光譜成像技術能夠廣泛用于無損檢測細胞、組織乃至器官的生物分子組織形態學，被認為是可能實現臨床醫學無損層析成像最有前途的光學手段之一。另一方面，在結直腸癌變進程中，組織體的微觀形態以及相關生化成分會發生改變并導致發射光譜發生相應變化，這種變化往往攜帶組織體病變信息，因此有可能作為結直腸癌早期診斷和治療評估的參數指標。

國內外許多研究組對多光子顯微成像技術開展了研究［23-31］，初步揭示了正常、癌前、癌變層狀上皮組織的內源性熒光差異［23］;證實了多光子顯微成像技術無需標記便可獲得細胞微結構詳細信息［24］;提出了一些用于表征和判定組織細胞生理和病理特性的指標參量:如細胞形態及其 NADH和FAD的雙光子激發熒光比值已被用作研究細胞能量代謝的一種重要指標［25，26］;膠原纖維以及彈性纖維含量、形態和方向及其SHG/TPEF強度比等參數被認為可用作表征癌變信息的評估指標［27-31］，等等。特別值得關注是，作者所在研究組首次提出采用多通道探測成像技術和光譜分辨成像技術相結合的多模式方法，對正常和異常人體皮膚、食道組織、口腔粘膜等上皮組織進行了高對比度和高分辨率的微結構光譜成像，初步提取了一些可用于表征組織病變信息的特征參量［32-36］。文獻［35］首次報道了結腸正常肌層內斜中橫外縱的肌纖維微結構特征以及癌細胞侵入肌層后微結構的變化，如圖3所示(紅偽彩色顯示是雙光子激發熒光信號(TPEF)，綠偽彩色顯示的是二次諧波信號(SHG)，圖3中白色環形曲線顯示腺癌占據了肌層空間，肌纖維嚴重缺失特別是產生SHG信號的網狀肌纖維。

圖3 左邊:正常結腸肌層內斜中橫外縱(imp-mmp-omp)的肌纖維微結構特征;右邊:中間肌層癌細胞侵入前后的微結構對比圖［35］Fig.3 left:inner oblique，middle transverse and outer longitudinal muscle fiber microstructure feature of normal colonic muscularis propia(imp-mmp-omp);right:the middle muscle fiber microstructure of normal and cancer cell invading into muscularis propia

盡管已有研究成果預示著多光子顯微成像技術在結直腸癌早期診斷和治療評估表現出誘人的前景和巨大潛力，但是，多光子顯微成像技術真正走向臨床應用還存在許多基本問題亟待解決。首先，結直腸癌變進程中，其內在組分如細胞、膠原纖維、彈力纖維等的形態、分布等結構特征存在差異，當飛秒激光與之相互作用時，這種差異性表現為吸收系數、散射系數以及衰減系數的差異，并最終影響成像的質量和深度。如何針對這種差異性選擇合適的激發波長和激發功率等激光輻照參數，以期獲得高分辨率、高對比度深度成像和光譜特性就顯的尤為重要。其次，不僅正常以及癌變不同病程結直腸組織的微觀形態存在差異，同一類型結直腸癌組織，其粘膜層上皮、固有腸腺以及粘膜下層膠原蛋白和彈力纖維等存在較大的個體差異。其微觀形態通常還隨病人的年齡、性別、癌變時間、病灶部位等存在差別，即使在同一樣品中，粘膜下層不同位置的膠原蛋白和彈力纖維形態也存在一定差異。如何從眾多差異中，提取能定量表征不同病程結直腸癌變信息的特征參量是實現結直腸癌早期診斷和治療評估的關鍵。此外，目前針對結直腸癌非線性光譜成像研究還主要局限于組織形態學層面，對癌癥的發生、發展和轉移，特別是術后的高復發還缺乏足夠的認識。因此，有必要研究結直腸癌細胞的生物學特性，建立能定量表征不同病程結直腸癌的細胞特征參數，監測癌變進程細胞代謝等功能特征，探索外界因素對細胞生長代謝等功能的影響。

6 拉曼光譜技術

蛋白質、脂類、碳水化合物和核酸四大類物質是構成正常細胞和組織的主要物質。細胞和組織的病變總是從構成他們的分子開始的，在細胞和組織早期病變過程中，這些化學物質、構象和數量都會發生明顯變化，這些早期的變化并不引起臨床癥狀和組織內在成分的微結構變化，以雙光子激發熒光(TPEF)和二次諧波(SHG)為信號源的非線性光譜成像技術顯然無法檢測這種變化，而拉曼光譜卻能反映這些變化。拉曼光譜技術能夠從物質的分子振動光譜來識別和區分不同的物質分子結構，從分子水平研究和判定生物組織內在成分的詳細信息，克服了熒光光譜技術區分病變組織的缺陷，即由于生物大分子熒光帶較寬，易重疊，影響診斷的準確性。因此，拉曼光譜有望成為癌癥早期診斷以及癌變機制研究的重要手段［37-41］。

早期，人們主要利用組織切片的拉曼光譜來分析癌癥腫瘤的類型，尋求不同類型癌癥診斷標志物。文獻［37］獲得了乳腺癌的拉曼光譜，結合數值擬合，得到了各種不同類型乳腺癌的基本特征物質的含量，該方法在從正常和良性組織中區分癌變組織的靈敏度和特異性分別達到了94%和96%;文獻［38］通過對比胃癌和正常胃黏膜的拉曼光譜，確定了胃癌的特征峰，證實拉曼光譜可用于來診斷胃癌。近年來，利用血清的拉曼光譜進行CRC的診斷引起人們的極大興趣。血清是人體血液中的重要組成部分，血清白蛋白富含多種蛋白質，可以全面表征個體信息，血清中的抗體(免疫球蛋白)是體內最主要的抗體，對各種細菌、病毒都有很強的抵抗力。分析血清的拉曼光譜可以深入了解血清中所包含各種物質的性質，它對臨床的研究有著極其重要的意義。特別是近年來表面增強拉曼散射(SERS)技術的發展，克服了常規拉曼的固有缺陷，能夠在幾秒時間內很容易探測到物質內部微觀世界的信息，同時又能夠對熒光產生很好的抑制、猝滅作用［39-42］。課題組前期工作已經利用SERS技術對鼻咽癌、胃癌和結直腸癌進行基礎研究，證實癌變組織與血液樣品生化成分、含量以及生物分子結構上與正常健康人樣品存在很大的差異［43-45］。文獻［45］對正常血清與結直腸癌血清的SERS平均光譜進行了對比分析，并且利用主成份統計分析方法對SERS光譜的主成份PC1，PC2，PC3進行了統計分析，靈敏度和特異性分別為84.2%，93.3＆% 和 92.1% ，95.6%，如圖 4 所示。

鑒于人體血液的多樣性和個體差異性，如何獲取CRC早期快速診斷拉曼特征標志譜是本領域研究的重點。在建立正常人血清主要成分的拉曼基本譜基礎上，進一步增加“個體化”擬合因子，同時構建分子拉曼計算模型，通過理論數值模擬與實驗分析，開展拉曼分子指紋特征譜的理論和實驗研究，構建拉曼早期快速診斷惡性腫瘤研究技術平臺，確定惡性腫瘤(乳腺癌和肝癌)快速診斷的拉曼指紋特征標志譜。

7 結論與展望

隨著分子生物、內鏡影像技術以及激光技術的發展，CRC診斷方法和方式不斷改進，新診斷方法和技術不斷涌現，為從細胞和分子水平認識結直腸癌類型和癌變進程以及療效評估提供研究手段和方法。對結直腸癌的早期診斷、定位和分期提高到了一個新的認知水平。尤其是以雙光子激發熒光和二次諧波為信號源的多光子顯微成像技術非常適合用于組織和細胞的微結構形態和內在成分光譜特性研究，而以拉曼散射效應為基礎建立起來的拉曼光譜技術，則可以從物質的分子振動光譜來識別和區分不同的物質結構，能夠提供生物組織內在分子組分的詳細信息。二者各具優點又能相互補充。無疑，聯合多光子顯微成像技術與拉曼光譜技術(MPM/RS)并進一步結合內窺鏡、微光纖技術將是未來結直腸癌早期無損診斷和治療評估的重要研究重點和方向，也是本論文作者正在開展的研究工作。進一步的研究將有望從分子水平和細胞水平認識結直腸癌產生、發展的內在機制，建立能夠定量表征正常以及不同病程結直腸癌的特征參數，為結直腸癌的早期無損診斷和治療評估提供參考指標和基礎數據，對結直腸癌早期防治具有重要指導意義和參考價值。

圖4 (A)正常血清與結直腸癌血清SERS平均光譜對比圖;(B，C)正常血清與結直腸癌血清SERS光譜的主成份PC1，PC2，PC3二維散點圖［45］Fig.4 (A)Comparison of the mean spectrum for the colorectal cancer serum(blue curve)versus that of the normal serum(red curve)samples.Each spectrum was normalized to the integrated area under the curve to correct for variations in absolute spectral intensity.The shaded areas represent the standard deviations of the means.Also shown at the bottom is the difference spectrum.(B)Plots of the first principal component(PC1)versus the second principal component(PC2)for normal group versus colorectal cancer group.(C)Plot of the first principal component(PC1)versus the third principal component(PC3)for normal group versus colorectal cancer group

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