2型糖尿病小鼠（KKAy）動物模型的早期腎臟病理改變

北京市懷柔區第一醫院（101400）王偉

隨著人口的老齡化和我國民眾飲食結構的改變，我國糖尿病（diabetes mellitus，DM）的發病率也呈持續上升趨勢。由于2型糖尿病發病率遠高于1型，患者年齡偏大，多合并高血壓及心腦血管性疾患，故對人類的危害更大。糖尿病腎病（diabeticnephropathy，DN）是DM最常見和最嚴重的并發癥之一。DN病理表現為腎小球硬化，發病早期表現為腎小球濾過率降低和正常白蛋白尿，繼而由于基底膜增厚導致微量白蛋白尿，后期出現持續的蛋白尿、水腫、高血壓等腎病表現。KKAy小鼠是自發2型糖尿病的動物模型[1]。其發病是在遺傳易感的基礎上加環境因素而誘發與人類2型糖尿病表現極為相似。本研究引進該動物模型，觀察其作為2型糖尿病致腎臟病模型的價值，探討其發病機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8周雄性KKAy小鼠8只和KK小鼠11只，采用普通飼料喂養。

1.2 實驗方法和取材 隨機血糖大于13.9mmol/L者診斷為糖尿病。實驗結束時取血測血糖等指標后，以3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速分離腎臟，留標本于4%中性甲醛，右腎置于液氮。

1.3 腎臟組織PAS染色 部分腎臟組織于4%中性甲醛中固定24h以上，常規脫水、透明、浸蠟和包埋，切片3μm厚，經PAS染色。

1.4 腎臟組織免疫組化染色 常規二甲苯、乙醇脫蠟至水，3% H202甲醇封閉內源性過氧化物酶，孵育20min后，以1∶100 VEGF抗體（一抗，北京中杉公司）4℃過夜孵育，陰性對照只加PBS液，辣根酶標記鏈親和素（二抗，北京中杉公司）室溫孵育60min后，以DAB法顯色。結果以IPP5.1圖像分析系統進行半定量分析，比較腎小球平均光密度（腎小球著色面積IOD/腎小球總面積）。

1.5 實時熒光定量PCR檢測腎皮質VEGF基因表達 用Trizol試劑（Invitrogen，美國）一步法提取大鼠腎臟總RNA，電泳判定RNA的質量。使用ReverTra Ace-α cDNA試劑盒（TOYOBO，日本）合成大鼠腎臟cDNA。體系20μL，5×RT buffer 4μL，dNTPs 2μL，Random Primer 1μL，ReverTra Ace 1μL，RNase inhibitor 1μL，RNA 3μL，RNase free H2O 8μL。反應條件：30℃ 10min，42℃ 20min，99℃5min，4℃ 5min。合成的cDNA于-80℃凍存。用ABI?PRISM 7300（美國 ABI Biosystem）實時熒光定量PCR儀進行基因檢測。SYBR? Green PCR Master Mix購自TOYOBO（日本）。體系50μL，SYBR?Green Real time PCR Master Mix 25μL，蒸餾水18μL，上游引物1μL，下游引物1μL，cDNA 5μL。反應條件：95℃ 60s，1循環；95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 45s，40循環。內參照為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）。引物均由上海生工生物公司合成。VEGF上游引物序列5’-TTACTGCTGTACCTCCAC-3’，下游引物序列5’- ACAGGACGGCTTGAAGATA-3’[2]；GAPDH上游引物序列5’-CATGCCAA CGCCCTCTTCGA-3’，下游引物序列5’-TGTCCCCGTTCTCATCCTGCAC-3’。使用2-ΔΔCT方法計算基因表達情況。

1.6 統計學分析 用SPSS10.0統計分析軟件處理實驗數據，所得數據符合正態分布的以（±s）表示，偏態分布的變量數據以中位數（范圍）表示，并經對數轉換使之正態化后采用t檢驗及方差分析進行統計分析。

2 結果

2.1 兩組腎皮質病理改變比較 實驗結束時KA組小鼠的血糖（19.75士3.98）mmol/L明顯高于KB組（8.14士3.15）mmol/L（P＜0.01）。PAS染色后光鏡下可見KA組有腎小球硬化表現，即ECM明顯增多，腎小球系膜區增寬、HE染色陽性物質增多，基底膜增厚，見附圖1。

2.2 腎小球VEGF的免疫組化比較 KA組小鼠腎小球系膜區、臟層上皮細胞、壁層上皮細胞、內皮細胞等多處腎小血管壁均出現了VEGF陽性著色，KB組個別也有VEGF陽性著色，但明顯輕于前者。圖像分析顯示KA組和KB組腎小球VEGF平均光密度分別為0.03和0.01（P＜0.01），見附圖2。

2.3 腎臟組織VEGF的real-time PCR比較KA組糖尿病小鼠腎臟VEGF mRNA表達明顯高于KB對照組17%（P＜0.01）。

3 討論

糖尿病腎病的主要病理變化是腎小球基底膜（GBM）和以腎小球系膜區為主的細胞外基質（ECM）積累，導致彌漫性或結節性腎小球硬化。從本實驗的病理檢查可見，KA組小鼠腎小球體積增大，PAS紅染區明顯擴大，腎小球毛細血管袢略顯僵硬，系膜基質增生，提示已經出現早期腎臟形態學改變，尤其是腎臟微血管損傷。糖尿病腎病的發病機制目前尚未完全闡明，研究認為有多方面因素參與，國內余葉蓉等研究顯示[3]，在胰島素抵抗狀態下，大血管內皮依賴性血管舒張功能是受損的。VEGF是目前所知作用最強的一種促血管生成因子，具有高度特異性地促血管內皮細胞生長的作用[4]。高血糖、組織低氧、氧化應激及多種細胞因子可刺激組織細胞產生VEGF。VEGF過度表達可通過改變內皮細胞的結構和功能，破壞血管內皮細胞的緊密連接，促進血管內皮細胞增殖等作用，從而改變細胞外基質分泌，增加毛細血管通透性，促進新生血管形成。它可以通過增加腎臟微血管的通透性和單核細胞的滲出參與腎損害的發生。有研究表明，糖尿病大鼠腎臟肌酐清除率、蛋白尿增加，可能與腎組織VEGF表達增加相關[5][6]。通過免疫組化和實時定量PCR方法也證實了KKay小鼠VEGF在腎臟的表達明顯增加。腎小球增高的VEGF在糖尿病腎病的發生、發展中作用復雜，不排除高血糖、糖基化終末產物、氧自由基等物質對毛細血管內皮細胞造成一定損害，內皮細胞分泌一些細胞分子，其中包括VEGF，加重內皮細胞的損傷，造成血管通透性增強，蛋白漏出，形成蛋白尿，漏出的蛋白又刺激細胞外基質增生加重腎小球硬化，參與糖尿病腎病的發生發展。

附圖1 兩組大鼠腎臟組織病理變化（PAS×400）

附圖2 兩組大鼠腎臟VEGF蛋白表達（×200）

綜上所述，VEGF作為DN的發生發展過程以及療效觀察的實驗室指標有著一定意義及臨床價值，對于監測早期DN的發生和病情發展程度有重要意義。