無患子種質資源多樣性與親緣關系的ISSR 和SRAP 分析

洪 莉，柏明娥，張加正，洪利興，沈建軍

(1.浙江省臺州市農業科學研究院，浙江 臨海 317000;2.浙江省林業科學研究院，浙江 杭州 310023)

無患子 (Sapindus mukorossi Gaertn.)又名肥皂樹，為無患子科無患子屬落葉喬木樹種，廣泛分布我國東部、南部至西南各省區，日本、朝鮮、越南、老撾、柬埔寨、緬甸、泰國、馬來西亞、尼泊爾和印度也有分布［1］。近年來研究表明，無患子果皮含有四環三萜類大戟烷型 (Tirucallane type)和達瑪烷型 (Dammarane type)等多種皂苷［2-4］，可作為天然活性物質用于洗滌和洗發香波及各種潔膚護膚化妝品中，具有抗皮真菌和念珠菌等抗菌、止癢、治療腳癬和輪癬等功效［5］，是當前日用化工業中非常引人關注的綠色洗滌生物化工原料，市場前景廣闊。目前，人工種植的無患子大多使用天然種源的實生苗，良種選育尚處于起步階段。辜夕蓉［6］對來自于四川和云南5個地方的無患子種源的種子品質進行研究和比較，以期從中找尋出優良種源，為無患子的栽后產量和品質打下基礎。邵文豪等［7-8］通過對不同產地無患子果皮皂苷含量的測定分析和收集無患子自然分布區內不同種源、家系種子進行播種育苗定期觀測，研究無患子不同種源皂苷含量和苗期生長變異規律與種源地生態因子之間的關系，以期為選擇高皂苷含量的優良種源區劃及遺傳改良提供理論依據。

簡單重復序列區間 (inter-simple sequence repeat，ISSR)是1994年由Zietkeiwitcz 創建的一種簡單序列重復間擴增多態性分子標記方法［9］，相關序列擴增多態性 (sequence-related amplified polymorphism，SRAP)是由美國加州大學Li 和Quiros 于2001年發展的一種基于PCR 反應的新型標記［10］。利用分子標記技術研究無患子種質資源遺傳多樣性的相關文獻鮮見報道。本研究采用ISSR 和SRAP 分子標記技術，選取來自浙江、湖南、四川等地的16 份無患子材料，通過探討不同產地無患子種源間的遺傳差異和親緣關系，旨在為科學實現遠緣雜交或遠親雜交提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2011年11-12月，在無患子不同分布區選擇樹齡20年以上、胸徑18 cm 以上且生長正常的無患子采集成熟果實，共收集13個產地16 份果實材料 (表1)。果實采集帶回室內，將種子剝離后濕沙埋藏，2012年3月進行播種試驗。試驗在浙江省臺州市農業科學研究院大棚內進行。臺州屬亞熱帶季風性濕潤氣候，四季分明，年均氣溫17℃，年降水量1 550 mm。土壤為砂壤土，pH 值6.1，地勢平坦，水源充足。2012年9月采集當年生幼樹嫩葉作分析測試樣品。

表1 供試無患子材料的情況

1.2 處理方法

1.2.1 無患子基因組DNA 的提取

基因組DNA 提取采用SDS-CTAB 法，DNA 粗提物再經Magabio 核酸純化試劑盒進行純化后，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳和DNA/RNA 紫外分光光度計 (GeneQuant Pro，GE Healthcare)檢測完整性、純度及濃度。D260/D280＞1.8 的DNA 樣品用于后續PCR 擴增。

1.2.2 ISSR 引物的選用和PCR 的擴增

ISSR 和SRAP 通用引物如表2 所示。

表2 ISSR 和SRAP 通用的引物序列

ISSR 和SRAP 擴增反應均采用20 μL 體系。2.0 μL 10× PCR Buffer，2.0 μL dNTP (each 2.5 mmol·L-1)，1.2 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，0.2 μL Taq DNA 聚合酶(1U)，模板DNA 60 ng，ISSR 引物1 μL (10 μmol·L-1)或SRAP 上下游引物各1 μL (10 μmol·L-1)，dd H2O 補足20 μL。

PCR 擴增反應在杭州博日公司的TC-XP 型擴增儀上進行。ISSR-PCR 擴增程序為94℃預變性4 min;94℃變性1 min，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，35個循環，循環結束后72℃延伸7 min，4℃保存。SRAP-PCR 擴增程序為94℃變性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，共5個循環，隨后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環結束后72℃延伸8 min，4℃保存。

1.2.3 數據處理與統計分析

PCR 擴增產物用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳，用Quantity One 6.0 分析軟件結合人工方法讀帶，記錄電泳圖譜中清晰且能重復出現的條帶，在相同的遷移位置上，有帶用1 表示，無帶用0 表示。采用NTSYS-pc2.10e 軟件的Simqual 程序計算樣品間的Dice 相似系數，同時用類平均聚類法 (UPGMA)進行聚類分析，構建聚類圖。

2 結果與分析

2.1 無患子種質的ISSR 和SRAP 分析

用優選出的13 條ISSR 隨機引物和3 對SRAP引物 (Me3-em7、Me3-em15、Me3-em17)對無患子基因組DNA 進行PCR 擴增，結果均能擴展出清晰穩定、重復性和多態性較高的條帶 (圖1-2)。不同引物擴增的DNA 片段為300～1 300 bp，DNA片段數目為2～12 條，平均每個引物擴增出5 條主帶，多態性條帶比率約為61%。

圖1 ISSR 引物UBC862 的PCR 擴增圖譜

圖2 SRAP 引物對Me3-em7 的PCR 擴增圖譜

2.2 遺傳相似系數的估算和聚類分析

圖3 為通過Dice 相似系數利用UPGMA 法構建的不同產地間無患子種質聚類分析樹狀圖。

圖3 16個無患子種質的UP GMA 聚類樹

聚類結果顯示，當Dice 相似系數為0.52 時，可將供試的無患子種質分為2個大類，第1 大類包括了15個無患子種質，第2 大類僅為四川成都1號1個種質;當Dice 相似系數為0.678 時，可以將第1 大類再分為2個亞類，第1 亞類包括來自福建和江西的3個無患子種質，第2 亞類包括來自浙江、湖南、湖北、安徽、四川、江西、福建的12個無患子種質。在第1 亞類中，來自福建三明和福建順昌的無患子種質以0.828 的Dice 相似系數聚在一起;在第2 亞類中，來自浙江金華和浙江麗水的無患子種質以0.854 的Dice 相似系數聚在一起，來自江西廬山和浙江臨安的以0.802 的Dice 相似系數聚在一起，來自安徽黃山和浙江臨海的以0.854 的Dice 相似系數聚在一起。從以上聚類結果可以看出，各無患子種質并未嚴格按地理界限聚在一起，僅部分來源于同一地區的無患子種質聚在一起，出現“大雜居、小聚居”的現象。

3 小結和討論

利用ISSR 和SRAP 分子技術對16個地區無患子種質進行遺傳多樣性分析，PCR 擴增圖譜上存在明顯的多態性，說明利用ISSR 和SRAP 標記可以從分子水平上揭示出不同產地無患子的基因組差異，在無患子種質鑒定和遺傳多樣性研究上具有重要價值。本研究中無患子種質的多態性比率約為61%，表明分布于不同產地的無患子具有較高的遺傳多樣性，各分布區的個體遺傳差異較大，這可能與其具有很強的適應不同氣候環境的能力相關。

在親緣關系上，遺傳距離越小，遺傳一致性越大，材料間的親緣關系也就越近，反之，親緣關系就較遠。在本研究的16個無患子種質中，親緣關系最近的是在第2 亞類中聚在一起的分布于浙江麗水和金華的種質，以及分布于安徽黃山和浙江臨海的種質。其次，分布于福建三明和順昌的種質，以及分布于江西廬山和浙江臨安的種質也有著較近的親緣關系，這些分布區的地理距離相對較近。親緣關系最遠的是分布于福建三明和四川成都的種質，相對地理距離較遠。此外，基于2種分子標記得到的無患子種質聚類結果并不與其地理分布一致，如同是分布于四川成都和湖南長沙的種質并未聚在一起，顯示了較大的基因組差異，表明無患子種質的遺傳變異與地理分布沒有呈現明顯的相關性。

無論ISSR 和SRAP 分子圖譜還是分子聚類結果，均顯示四川成都1號種質與其他種質在分子水平上存在明顯差異，這為我們后續在無患子的雜交育種計劃中親本選擇提供了優先選擇的材料。

［1］中國植物志編輯委員會.中國植物志 四十七卷 (第一分冊)［M］.北京:科學出版社，1998.

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［5］孫潔如，陳孔常，周鳴方，等.無患子表面活性物及其復配體系的性質研究［J］.日用化學工業，2002，32 (4):16-18.

［6］辜夕容.不同種源無患子的種子品質差異分析［J］.西南大學學報:自然科學版，2009，31 (6):51-54.

［7］邵文豪，姜景民，董汝湘，等.不同產地無患子果皮皂苷含量的地理變異研究［J］.植物研究，2012，32 (5):627-631.

［8］邵文豪，岳華峰，姜景民，等.不同種源無患子苗期生長性狀遺傳變異研究［J］.浙江林業科技，2012，32 (1):21-25.

［9］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeats (SSR)-anchored PCR amplification［J］.Genomics，1994，20:176-183.

［10］Li G，Quiros C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging in Brassica［J］.Theoretical and Applied Genetics，2001，103:455-461.