HPLC法測定利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿

賀康洪，林 陽，趙文軍，侯佳寧

（1. 沈陽軍區聯勤部藥品儀器檢驗所，遼寧 沈陽 110026； 2. 沈陽軍區政治部門診部，遼寧 沈陽 110000）

利咽顆粒是沈陽軍區某醫院制劑，用于治療因風熱郁肺、肺胃蘊熱所致咽部紅腫、咽痛、口干舌燥，干咳少痰有顯著療效。由北豆根、麥冬、天冬、桔梗、甘草等中藥組成，其中北豆根為方中君藥。北豆根富含生物堿，總生物堿的含量約為1.7%～2.5%，其中脂溶性生物堿蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿（結構式分別見圖1）的含量最高，具有抗心律失常、抗高血壓、抗腫瘤、鎮痛消炎多種藥理活性[1－7]，李可強[8]等采用HPLC法測定了北豆根中粉防己堿和青藤堿的含量，但兩種成分不能同時測定，操作復雜，覃芳[9]和李廣生[10]等進行北豆根指紋圖譜研究和北豆根膠囊含量測定時，分別對蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿進行測定，但未見文獻報道同時測定中藥復方制劑中兩種成分的含量，本方擬同時測定該制劑兩種成分的含量，從而為制劑質量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Angilent高效液相色譜儀 1100, Chemistatain system工作站（Angilent America），KQ-100型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，L-200SM 電子分析天平(十萬分之一 Shimadzu Corporation Japan)。甲醇、乙腈(色譜純，Fisher Scientific),三乙胺（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司），水為重蒸餾水。

利咽顆粒(批號 20120120，20120226，20120228，20120531，20120819，20120919，20121112，20121122)購自沈陽軍區某醫院；蝙蝠葛對照品(批號 111867－201001)和蝙蝠葛蘇林堿對照品（面積歸一化法測純度﹥98%），黑龍江省藥檢所實驗室制；藥材飲片購自沈陽太原街同仁堂藥店。

圖1 蝙蝠葛堿（A）和蝙蝠蘇林堿（B）結構式Fig.1 The structures of dauricine (A) and daurisoline (B)

1.2 色譜條件及系統適用性試驗

色譜柱：DiamonsilTMC色譜柱(4.6 mm×25018mm，5 m)；流動相A: 0.05%三乙胺水溶液，B: 乙腈，洗脫梯度:0～5 min, 25%～45%B；5～15 min，45%～60%B；15～20 min，60%～80% B；20～25 min，80%～80% B；流速: 1.5 mL·min-1，柱溫: 35 ℃；檢測波長: 284 nm；進樣量: 20 μL。

在擬定的色譜條件下測定，蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，對稱因子均在0.95～1.05之間。陰性樣品溶液色譜圖顯示在蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿出峰位未見其它色譜峰干擾，典型色譜峰圖見圖2。

1.3 對照品溶液制備

取蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對照品適量，精密稱定，加50%甲醇溶解并定量稀釋至刻度，搖勻，制成濃度分別為 44.24 μg·mL-1和 56 μg·mL-1的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對照品儲備溶液。

1.4 線性關系考察

精密量取蝙蝠葛堿對照品儲備溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL和蝙蝠葛蘇林堿對照品儲備溶液1、2、3、4、5 mL，同置10 mL容量瓶中，加為50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。按“2.1”項下色譜條件下進樣測定。以蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿對照品溶液（X:μg·mL-1）)為橫坐標,分別與其相應的蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線并進行回歸計算，得2種成分的標準曲線回歸方程（n = 5）分別為：

結果表明蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿質量濃度分別在1.106～8.848 μg·mL-1、5.6～28 μg·mL-1內與峰面積呈良好線性關系。

1.5 供試品溶液及陰性對照溶液的制備

取利咽顆粒約1.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加50%甲醇25 mL，浸泡30 min，稱重，超聲處理(功率100 W，頻率50 kHz) 30 min，放冷，用體積分數為50%甲醇補足減失的重量，濾過，取續液用0.45 μm濾膜濾過即得。

按處方量1 / 10分別稱取除北豆根外的其余各味藥材，加入10倍量的水浸泡1 h，回流提取1.5 h，濾過；殘渣再加入10倍量的水，繼續回流提取1 h，濾過，合并煎液，濃縮。用0.45 μm微孔濾膜濾過，制成北豆根陰性對照溶液。

圖2 蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿液相色譜圖Fig.2 Tipycal chromatograms of dauricine and daurisoline in Liyan granules

1.6 精密度試驗

取同一混合對照品溶液,精密量取 20 μL，連續進樣6次，結果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿面積的RSD分別為1.5 %和0.8 %，表明該方法精密度良好。

1.7 穩定性試驗

取利咽顆粒樣品（產品批號：20120228）約1.0 g，精密稱定。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，分別在0、1、2、4、8、12 h時測定，結果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿峰面積的 RSD分別為0.7%和1.6%。表明供試品溶液室溫放置12 h內基本穩定。

1.8 重復性試驗

取批號為20120228的利咽顆粒樣品，按“2.4”項下方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項下色譜條件測定，結果蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的RSD分別為2.0 %和1.3 %。表明重復性良好。

1.9 回收率試驗

取已知含量的利咽顆粒（產品批號：20120228）9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品，按“2.4”項下方法制成低、中、高3個濃度的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定。結果見表1。

表1 利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的回收率(n = 9)Table 1 Results of the recoveries of daurieine and daurisoline in Liyan granules ( n = 9 )

1.10 含量測定

取所收集的各批次利咽顆粒，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定，按外標一點法計算樣品中2種成分的含量，結果見表2。

表2 利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量測定結果 (μg·g-1，n=3)Table 2 Contents of daurieine and daurisoline in Liyan granules (μg·g-1，n=3)

2 結果與討論

2.1 供試品溶液制備方法的選擇

考察了浸泡超聲和加熱回流兩種提取方式，比較兩種方法制備的供試品液中兩種成分的峰面積，結果表明回流效率不高，采用浸泡、超聲30 min作為最終提取方式。考察了 30%甲醇-水溶液、50%甲醇-水溶液、70%甲醇-水溶液、100%水和 100%甲醇，不同濃度甲醇-水溶液的提取效率，以及用堿調節提取溶劑的pH值，結果表明50%甲醇-水溶液為提取溶劑測得兩種待測成分的含量最高。在提取溶劑中加氨水或氨試液制得供試品溶液未檢出以上兩種成分，表明蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿為非游離生物堿。因此選取50%甲醇-水作為提取溶劑。

2.2 檢測波長及洗脫程序的選擇

蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的吸收波長分別在284、282和280 nm[8-10]均有報道，本實驗也比較了在以上3個吸收波長處待測成分的色譜峰面積，結果相差很小，以284 nm處峰面積最大。考察了等度和梯度兩種洗脫方法，結果等度洗脫色譜峰對稱性差，尤其是蝙蝠葛堿拖尾嚴重，因此選擇檢測波長284 nm，梯度洗脫為最終檢測條件。文獻[7]報道蝙蝠葛蘇林堿見光易分解、不穩定，因此對照品溶液應用時新制，且操作過程中應避光。

3 結 論

建立了測定利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的HLPC方法，操作簡便，重復性好，可用利咽顆粒中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿含量的測定。本實驗對8個批次利咽顆粒中上述兩種成分進行了含量測定，發現各批次的品中蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的含量有差別，但蝙蝠葛堿和蝙蝠葛蘇林堿的含量均不低于100.0 μg·g-1和200.0μg·g-1。其含量對藥效學作用的影響需要進行藥效實驗來確定。

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