運動訓練對大鼠運動能力和不同類型肌纖維自由基代謝的影響

陳珍珍，鄭建飛，林 誠，曾曉芳，潘燕霞

運動疲勞是限制運動的主要因素，但機制尚未完全清楚。研究顯示，高強度運動時自由基大量生成，造成骨骼肌細胞損傷，是運動疲勞的主要機制［1－2］。然而，體內存在清除自由基的抗氧化系統，包括抗氧化酶和非酶類抗氧化劑，以保持自由基平衡。研究發現，中低強度的慢性運動（運動訓練）能增強骨骼肌總抗氧化能力（T－AOC）和抗氧化酶活性，降低骨骼肌自由基水平［3－5］；而大強度耐力訓練則降低骨骼肌抗氧化酶活性，增加自由基水平［1，6］。造成這種差異除了與運動強度有關，還與骨骼肌纖維類型有關。Hollander等認為，不同強度的運動訓練對自由基影響的差異，其基礎是參與的骨骼肌纖維類型不同所致［7］。但多數研究仍以整個骨骼肌為研究對象，對不同類型肌纖維的自由基和抗氧化酶的研究較少。少數文獻報道力竭運動結束即刻的不同類型肌纖維的自由基變化［7－8］，但對力竭運動恢復期不同類型肌纖維自由基變化并不清楚。為了探討運動訓練對不同類型肌纖維自由基代謝的影響，本實驗以大鼠比目魚肌（Ⅰ纖維）、腓腸肌（Ⅱa和Ⅱb纖維）為研究對象，觀察中低強度運動訓練對大鼠運動能力的影響以及力竭運動恢復期不同類型肌纖維丙二醛（MDA）含量、T－AOC、超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化，旨在揭示運動訓練提高骨骼肌運動能力和抗疲勞的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 成年雄性SD 大鼠26只［中國科學院上海實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK（滬）－2007－005）］，體質量300～350g。隨機分成安靜組（n＝6）、非訓練組（n＝10）和訓練組（n＝10）。訓練組大鼠進行8周跑臺運動，并在運動前和運動結束后24h進行運動能力測試；非訓練組大鼠除了在相同時間點進行運動能力測試外，其余時間自由活動；安靜組大鼠自由活動，未進行任何干預，作為安靜狀態自由基水平的對照值。動物房溫度21～23℃，濕度40%～60%，自由攝食飲水。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 FT－200動物電動跑臺（成都泰盟科技有限公司），ELX800 型酶標儀（美國BioTek公司），FSH－Ⅱ型高速電動勻漿器（江蘇金壇市環宇科學儀器廠），離心機（美國Themo公司）。MDA、SOD、T－AOC試劑盒（南京建成生物工程研究所），BCA 蛋白測定試劑盒（江蘇碧云天科技公司）。

1.2.2 運動訓練方案 運動組大鼠采用遞增強度的耐力訓練方案［9］，每天在跑臺上運動60 min，每周6d，共8周。具體方法如下：動物跑臺一端鋪有電柵，必要時通以電流驅趕動物。第1周，跑臺速度10～15m／min，運動時間從10min／d開始，每天延長10min，直至60min／d；第2周，運動時間固定60 min／d，跑臺速度從10～15m／min逐漸增至15～20 m／min；第3周開始，跑臺速度和運動時間固定在20m／min和60min／d，直至運動訓練結束，這一訓練方案的運動強度達55% 最大攝氧量（VO2max）［9］。實驗過程中配合手動木棍驅趕，以減少電刺激對動物造成的應激。跑道鐵質隔板下方進行必要防護處理，以防止大鼠尾部皮膚刮傷。訓練組無大鼠死亡，其中1只因不能穩定在跑臺上運動，中途退出；余9只大鼠的數據納入統計學分析。

1.2.3 運動能力測試 運動訓練之前，訓練組和非訓練組大鼠進行運動能力測試，以了解運動能力的基礎水平。測試前3d放入跑臺，以10m／min速度，每天運動10min以適應跑臺。測試時，跑臺速度從10 m／min，每3 min 增 加3 m／min，直 至31m／min，維持此速度直至動物出現力竭體征，記錄最大運動距離和運動時間。力竭的判斷標準：動物從跑臺履帶上落到跑臺后部，電擊和木棒驅趕無效，動物身體蜷縮、背部弓起，呼吸急促等，頑固拒跑［8］。8周訓練結束后，再次測試兩組大鼠運動能力。

1.2.4 不同類型肌纖維MDA、T－AOC、SOD 活性測定 訓練組與非訓練組大鼠在第2次運動能力測試結束后24h，在深麻醉下迅速分離大鼠比目魚肌（Ⅰ型）和腓腸肌（Ⅱ型），在冰盤上再分離出淺層腓腸肌（Ⅱb型）和深層腓腸肌（Ⅱa型）；安靜組大鼠于對應時間點取材。所有肌肉標本－80℃保存待測。檢測時，冷凍的肌肉組織按1∶9質量比加入預冷生理鹽水，剪碎組織，移入試管，試管浸在冰水中，用電動勻漿機進行勻漿，4℃離心（3 000r／min）10～15min，取上清，分裝成小份，－20℃保存待測。MDA 采用硫代巴比妥酸法，SOD 測定采用黃嘌呤氧化酶法，T－AOC的檢測采用菲林法，按照說明書進行加樣操作，用酶標儀測定標本吸光度；BCA 法測定組織蛋白濃度，上述指標的單位以每毫克蛋白（mg prot）表示。

1.3 統計學處理 數據以±s表示，采用SPSS 17.0軟件處理數據。3組間比較采用單因素方差分析，組間差異有意義是采用SNK－q檢驗進行兩兩比較。訓練前后大鼠運動能力變化采用配對t檢驗，P＜0.05為差別有統計學意義。

2 結果

2.1 運動訓練對大鼠運動能力的影響 運動訓練前，訓練組和非訓練組最大運動時間和運動距離無顯著差別（表1）。運動8周后，訓練組最大運動時間和運動距離較運動前顯著提高，分別從（10.8±1.5）min和（145.8±24.3）m 增加到（22.3±2.8）min和（428.6±68.3）m（P＜0.01），且均高于非訓練組（P＜0.01）。

表1 運動訓練對大鼠運動能力的影響Tab 1 Effect of exercise training on the exercise capacity in rats

2.2 運動訓練對不同類型肌纖維MDA的影響安靜組Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb三種纖維的MDA 含量經方差分析，差別有統計學意義（F＝5.5，P＝0.013）；兩兩比較結果顯示，Ⅰ與Ⅱa纖維MDA 含量相當，但高于Ⅱb纖維（表2，P＜0.05）。與安靜組比較，非訓練組Ⅰ纖維MDA 含量輕度升高，但差別未達到統計學意義；Ⅱa、Ⅱb纖維MDA 含量較安靜組分別升高了44%和160%（表2，P＜0.01）；而訓練組Ⅰ、Ⅱa纖維MDA 含量與安靜組相比無明顯差異，Ⅱb纖維MDA 含量較安靜組升高了133%（表2，P＜0.01）。

2.3 運動訓練對不同類型肌纖維T－AOC的影響安靜組Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb三種纖維的T－AOC經方差分析，差別無統計學意義（F＝0.73，P＝0.494）。與安靜組比較，力竭運動降低非訓練組Ⅱb纖維T－AOC（表2，P＜0.05），但對Ⅰ、Ⅱa纖維T－AOC抑制作用尚未達到統計學意義；力竭運動后，訓練組Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb纖維T－AOC均明顯高于非訓練組（P＜0.05），且訓練組Ⅰ、Ⅱa纖維T－AOC 也高于安靜組（表2，P＜0.05）。

2.4 運動訓練對不同類型肌纖維SOD 活性的影響安靜組Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb三種纖維的SOD 含量經方差分析，差別無統計學意義（F＝0.73，P＝0.494）。與安靜組相應類型纖維比較，力竭運動后，非訓練組Ⅰ、Ⅱa和Ⅱb纖維SOD 活性無明顯改變；訓練組Ⅰ和Ⅱa纖維SOD 活性較安靜組分別升高了39%和33%（表2，P＜0.05），Ⅱb纖維SOD 活性則無明顯改變。

表2 運動訓練對大鼠不同類型肌纖維MDA、T－AOC 及SOD 活性的影響Tab 2 Effects of exercise training on MDA，T－AOC and SOD activity in different muscle fibers in rats

3 討論

運動疲勞是骨骼肌運動能力下降的表現，也是限制運動的主要因素。但是，中低強度的慢性運動（運動訓練）能提高骨骼肌運動能力、減輕運動疲勞。本實驗觀察到，8周中低強度跑臺訓練明顯增加大鼠到達力竭運動的時間和距離，表明運動訓練能增強骨骼肌運動能力、延緩運動疲勞的發生。運動訓練抗疲勞的機制目前尚未完全清楚。多數研究顯示，適度運動能降低骨骼肌自由基含量，預防或減輕自由基對骨骼肌細胞造成的損傷，發揮抗疲勞作用［3－5］。但也有文獻報道，大強度運動訓練后，骨骼肌內自由基水平升高，反而加重骨骼肌的運動損傷［1，6］。不同強度的運動訓練對骨骼肌自由基代謝產生截然相反的影響，除了與運動強度有關外，還決定于不同類型骨骼肌纖維的結構和功能特點。骨骼肌纖維主要分為Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb型。Ⅰ型肌纖維富含肌紅蛋白，有氧代謝和抗疲勞能力強，但收縮速度慢；Ⅱb 型肌纖維收縮速度快，但抗疲勞能力弱；Ⅱa型肌纖維介于Ⅰ型和Ⅱb型之間，收縮速度快，抗疲勞能力強。本實驗結果顯示，安靜時三種類型骨骼肌纖維MDA 含量不同，Ⅰ型和Ⅱa型纖維的MDA 含量高于Ⅱb型，這種差異可能與Ⅰ型和Ⅱa型纖維富有肌紅蛋白、有氧代謝酶活性較高的特點有關，也說明不同類型肌纖維自由基的基礎水平可以有所不同。陳英杰等應用電子自旋共振法（ESR）技術直接檢測骨骼肌內自由基信號，也證實安靜時紅肌的自由基含量高于白肌［8］。

力竭是骨骼肌運動能力暫時喪失的一種表現，可能由長時間、大強度運動導致骨骼肌內自由基堆積對細胞造成損傷和功能抑制所致［2］。但力竭是可逆的，多數研究檢測了力竭運動即刻骨骼肌中自由基的變化，對恢復期的變化報道甚少。本研究檢測力竭運動恢復期骨骼肌自由基變化，正是為了比較訓練和非訓練骨骼肌運動能力恢復的差異。結果顯示，非訓練組Ⅰ、Ⅱa、Ⅱb肌纖維MDA 含量較安靜組分別升高了18.5%，44%和160%，而訓練組Ⅰ、Ⅱa肌纖維MDA 含量與安靜組相比無明顯差異，僅Ⅱb肌纖維MDA 含量高于安靜組，而且訓練組Ⅱb肌纖維MDA 升幅小于非訓練組，提示運動訓練能增強Ⅰ、Ⅱa型纖維自由基代謝，加速自由基清除，促進骨骼肌運動功能的恢復。

自由基清除速度快慢與體內抗氧化能力有關，包含抗氧化酶和抗氧化物質。SOD 是清除自由基的第一道防線，SOD 將超氧陰離子轉化為過氧化氫（H2O2），在過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶作用下，H2O2進一步轉化生成H2O，并釋放O2。大量研究表明，運動訓練能增強骨骼肌SOD 活性，但對不同類型肌纖維SOD 活性的影響是否相同目前并不清楚。本研究發現，運動訓練提高Ⅰ型和Ⅱa纖維SOD 活性，對Ⅱb纖維SOD 活性無明顯影響，而非訓練組三種肌纖維SOD 活性與安靜組相比均無明顯改變。這一結果表明運動訓練主要提高Ⅰ和Ⅱa纖維SOD 活性，這可能是訓練組Ⅰ型和Ⅱa纖維MDA 含量低于安靜組的原因。而運動訓練增強SOD 活性的機制，Hollander 等認為主要與增加Mn－SOD蛋白表達有關［7］。本研究還顯示，非訓練組Ⅱb纖維T－AOC降低，這可能與力竭運動后骨骼肌內抗氧化物質含量降低有關［8，10］。因此，訓練組Ⅰ、Ⅱa纖維T－AOC升高，主要與SOD 活性提高有關。除了SOD，T－AOC 升高還可能與運動訓練后過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶活性增強有關［5，11］。至于運動訓練是否提高不同類型肌纖維這兩種抗氧化酶的活性有待今后進一步研究。

總之，本實驗結果表明，運動訓練提高Ⅰ和Ⅱa型肌纖維總抗氧化能力和抗氧化酶活性、降低自由基水平，這可能是運動訓練提高骨骼肌運動能力對抗運動疲勞的細胞機制。

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