RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定夏桑菊顆粒中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷

林麗美，夏伯候，劉菊妍，李 春，何迎春，姚江雄，許招懂，梁 航，廖端芳*

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410208;2.湖南省中藥不良成分快速檢測(cè)及脫除工程技術(shù)研究中心，湖南長(zhǎng)沙 410208;3.廣州醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，廣東廣州 510130;4.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700;5.廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司，廣東廣州 510288)

夏桑菊顆粒為夏枯草、桑葉、野菊花三味藥材經(jīng)加工制成，商品規(guī)格20袋/包，10 g/袋，具有清熱解毒，清肝明目之功效。常用于風(fēng)熱感冒，目赤頭痛，高血壓等癥。夏桑菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)停留在部頒標(biāo)準(zhǔn)層次，該標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了該藥品的處方、制法、性狀、鑒別、檢查、主治與功能、用量與用法、規(guī)格和貯藏九個(gè)項(xiàng)目，缺乏含量測(cè)定項(xiàng)［1］，導(dǎo)致市場(chǎng)上夏桑菊顆粒質(zhì)量參差不齊，人民健康受到威脅。對(duì)于夏桑菊顆粒的君藥夏枯草，研究相對(duì)較多。目前已有采用紫外-可見分光光度法和HPLC對(duì)夏枯草中迷迭香酸量進(jìn)行了測(cè)定［2-4］，且對(duì)其降血壓、降血糖、降血脂、抗腫瘤、抗病毒等藥理作用進(jìn)行了較多研究［5-7］。本課題組前期對(duì)夏桑菊顆粒開展了指紋圖譜研究［8-9］，同時(shí)參考2010年版《中國(guó)藥典》選擇夏枯草測(cè)定指標(biāo)迷迭香酸和野菊花測(cè)定指標(biāo)蒙花苷作為夏桑菊顆粒成分定量測(cè)定的兩個(gè)質(zhì)量控制成分［10-11］，但是非同步測(cè)定。基于此，本課題組在前期工作基礎(chǔ)之上，同步測(cè)定迷迭香酸和蒙花苷的同時(shí)，增加了夏枯草果穗的特征成分異迷迭香酸苷［12］和三味藥材共有成分綠原酸的定量測(cè)定。通過開展該研究，為夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考和借鑒，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 KQ-100B型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);BPZ11D型電子分析天平(Sartorius公司);Waters2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)，Empower工作站，含四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器(Waters公司)。

1.2 試劑 甲醇(色譜純，TEDIA公司)，乙腈(色譜純，TEDIA公司)，水為哇哈哈純凈水，冰乙酸(色譜純，北京化工廠)。

1.3 對(duì)照品及樣品 對(duì)照品綠原酸［13］、異迷迭香酸苷［12］和迷迭香酸［12，14］(本課題組自制，純度大于98%)，蒙花苷(批號(hào):111528-200202，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，4種對(duì)照品的具體結(jié)構(gòu)式見圖1～4);夏桑菊顆粒由廣州白云山星群(藥業(yè))股份有限公司提供。

圖1 綠原酸Fig.1 Chlorogenic acid

圖2 異迷迭香酸苷Fig.2 Salviaflaside

圖3 迷迭香酸Fig.3 Rosmarinic acid

圖4 蒙花苷Fig.4 Linarin

2 HPLC測(cè)定

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5μm);體積流量 1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm;柱溫30℃;樣品溫度20℃;進(jìn)樣體積10μL;流動(dòng)相為乙腈(A)-1.0%醋酸水(B)梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?→40 min，10%A→30%A。按照上述色譜條件，待測(cè)成分綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷分離很好，無干擾，見圖5。

圖5 對(duì)照品(A)和夏桑菊顆粒(B)高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and Xiasangju Granules(B)

2.2 供試品溶液制備 稱取夏桑菊顆粒及相應(yīng)的陰性樣品約2.5 g，精密稱定，加甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲 30 min(功率 250 W，頻率 40 kHz)，取出，靜置，放涼，補(bǔ)足失質(zhì)量，0.22μm微孔濾膜濾過，HPLC分析。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取綠原酸、迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品適量，用甲醇溶解，定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.0389μg/μL、0.0480μg/μL和0.0386μg/μL 的對(duì)照品溶液。精密稱取異迷迭香酸苷適量，配置成質(zhì)量濃度為0.2104μg/μL，再稀釋為 0.033664μg/μL 和0.006733μg/μL的對(duì)照品溶液。

分別精密吸取綠原酸、迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品溶液 1、3、5、8、10、15和 20μL進(jìn)樣分析，記錄按上述色譜條件測(cè)定的峰面積。分別精密吸取質(zhì)量濃度為0.2104μg/μL的異迷迭香酸苷對(duì)照品溶液2、5、10、15、20μL;質(zhì)量濃度為0.033664μg/μL的異迷迭香酸苷對(duì)照品溶液1、2、5、10、15、20μL;質(zhì)量濃度為0.006733μg/μL 的異迷迭香酸苷對(duì)照品溶液 1、2、3、5、10、15、20μL，記錄按上述色譜條件測(cè)定的峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣體積為橫坐標(biāo)，得綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的線性回歸方程分別為:Y=182283X－131274(r=0.9994，0.0389～ 0.7771μg)、Y=9109021 X － 32842(r=0.9999，0.0067 ～ 4.200μg)、Y=178507 X －142821(r=0.9992，0.0480 ～0.9600μg)和 Y=99764 X－73510(r=0.9992，0.0386～0.7714μg)。

2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取上述配制好的同一對(duì)照品溶液10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其 RSD分別為0.18%、0.53%、0.44%和0.49%。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品溶液(批號(hào) JA10123)10μL，分別在 2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其RSD分別為1.21%、1.52%、0.88%和0.91%。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品(批號(hào)JA10123)6份，精密稱定，制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的峰面積，其 RSD分別為 1.43%、0.99%、1.18%和1.11%。

2.7 回收率試驗(yàn) 取同一批已知含有量的夏桑菊顆粒樣品(批號(hào)JA10123)約1.25 g，精密稱定，分別精密加入一定量綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)制成加樣供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests(n=6)

2.8 樣品測(cè)定 按照上述色譜條件，將不同廠家的樣品進(jìn)行處理和進(jìn)樣，每一個(gè)相同廠家及批號(hào)的樣品測(cè)3份，采用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算夏桑菊顆粒中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的平均含有量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 4個(gè)指標(biāo)成分均為酚酸或黃酮，在甲醇中有較好的溶解度，選擇甲醇超聲，處理容易、可控;且樣品呈酸性，選擇醋酸水溶液作為水相，水相中醋酸比例是通過單因素多水平試驗(yàn)確定最佳比例為1.0%。選擇乙腈作為有機(jī)相來分析中藥復(fù)方，柱壓穩(wěn)定且較低，有利于保護(hù)儀器和色譜柱。波長(zhǎng)選擇320 nm也是基于所測(cè)化合物在該波長(zhǎng)處均有明顯吸收，且雜質(zhì)干擾較少。梯度選擇均一梯度變化以保證樣品具有更好的重復(fù)性。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of sample assay(n=3)

3.2 測(cè)定結(jié)果表明，相同廠家夏桑菊顆粒4種活性成分綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷的含有量相對(duì)穩(wěn)定，不同廠家之間4種成分含有量差別極大，甚至有大部分廠家的樣品中不能夠同時(shí)測(cè)出4種活性成分，說明含某(幾)種活性成分的量極低甚至沒有。可見，市面上流通的不同廠家夏桑菊顆粒質(zhì)量極不一致。為了促進(jìn)名優(yōu)大品種的發(fā)展、維護(hù)優(yōu)勢(shì)合法企業(yè)和保障人民健康用藥，提高夏桑菊顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。同時(shí)建議質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中綠原酸、異迷迭香酸苷、迷迭香酸和蒙花苷4種活性成分的含有量下限分別為 1.50、0.20、2.00和1.00 mg/袋。

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是一個(gè)復(fù)雜艱巨體系［15］，但其重要性激勵(lì)著科研工作者不斷的探索和創(chuàng)新［16-17］。建立和提高夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是為了將假藥和劣藥攔在流通大門之外，而目前以假亂真、以次充好的技術(shù)是與時(shí)俱進(jìn)的，因此質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與完善也是與時(shí)俱進(jìn)的。本課題組接下來將從特征圖譜和指紋圖譜方面繼續(xù)研究夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為建立夏桑菊顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供參考，達(dá)到有效控制夏桑菊顆粒質(zhì)量之目的。

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