應(yīng)用GC-O 和GC-MS 分析醬香型習(xí)酒中揮發(fā)性香氣成分*

王曉欣，范文來，徐巖

(教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)生物工程學(xué)院釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室，江蘇 無錫，214122)

醬香型白酒屬于我國三大典型香型白酒之一，采用獨(dú)特的“高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫餾酒、多輪次取酒”的生產(chǎn)工藝［1］，酒體具有“無色透明，醬香突出、幽雅細(xì)膩，空杯留香持久，入口柔綿醇厚，回味悠長”［2］的風(fēng)格特點(diǎn)。

與其他香型的白酒相比，醬香型白酒風(fēng)味成分眾多，香氣復(fù)雜，關(guān)鍵香氣成分至今尚未確定［3］。2007年，Zhu 等［4］利用全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC-TOFMS)鑒定出茅臺酒528 種組分;2010 年，F(xiàn)an等［5］通過攪拌棒吸附萃取(SBSE)和氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)，定量了醬香型郎酒中76 種香氣化合物;2012 年，F(xiàn)an 等人［6］應(yīng)用GC-O 和GC-MS 在醬香型茅臺與郎酒中檢測到186 種香氣活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)重要的風(fēng)味化合物是己酸乙酯、己酸、3-甲基丁酸、3-甲基丁醇、2，3，5，6-四甲基吡嗪、2-苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、3-苯丙酸乙酯、4-甲基愈創(chuàng)木酚和γ-癸內(nèi)酯等;同時發(fā)現(xiàn)大量的吡嗪類化合物對風(fēng)味有明顯貢獻(xiàn)。同年，汪玲玲等［7］應(yīng)用液液微萃取和GC-MS 研究醬香型白酒骨架成分，證實(shí)三甲基吡嗪、4-乙基愈創(chuàng)木酚、糠醛和呋喃扭爾等不是醬香型白酒的特征醬香物質(zhì)。

近年來，氣相色譜-聞香法(GC-O)已經(jīng)廣泛用于我國飲料酒香氣成分分析，如白酒［8－12］，黃酒［13］，葡萄與葡萄酒［14－15］，蘋果酒［16］等。本研究以醬香型習(xí)酒為研究對象，采用液液萃取濃縮風(fēng)味物質(zhì)，并將化合物按酸堿性分離，減少色譜重疊峰，通過GC-O 和GC-MS 分析，并確定醬香型習(xí)酒重要香氣成分，為指導(dǎo)醬香型習(xí)酒的釀酒、勾兌與品質(zhì)控制提供重要支撐。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

醬香型習(xí)酒:由貴州茅臺酒廠(集團(tuán))習(xí)酒有限責(zé)任公司提供;戊烷:色譜純，購自德國CNW 公司;無水乙醚、氯化鈉、無水硫酸鈉:分析純，購自上海國藥集團(tuán);鑒定中標(biāo)明有RI 的化合物:色譜純，購自Sigma-Aldrich(上海)公司。

Agilent GC 6890 N 氣相色譜和5975 MSD 質(zhì)譜儀:美國安捷倫公司;DC-12 氮?dú)獯祾邇x、FFAP 色譜柱柱(60 m ×0.25 mm ×0.25 μm):上海安譜科學(xué)儀器有限公司;ODP2 聞香儀:德國Gerstel 公司;Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國Millipore 公司;超聲波清洗儀，天津Autosciennce 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液液萃取

參考Fan 等［9］報道的香氣物質(zhì)提取方法，50 mL白酒酒樣用煮沸的超純水稀釋至酒精度10%vol，加NaCl 飽和。用30 mL 重蒸溶劑(戊烷∶乙醚體積比1∶1)在分液漏斗中分3 次萃取，通過調(diào)pH 將萃出組分逐步分成酸性/水溶性、中性和堿性組分，加無水Na2SO4置于－20℃下干燥12h 后，氮吹濃縮至200 μL，用于GC-MS 定性和GC-O 分析。

1.2.2 GC-O 分析

參考Xu 等人［16］的分析方法，挑選兩名經(jīng)過聞香訓(xùn)練的碩士研究生進(jìn)行GC-O 分析。采用時間強(qiáng)度法，同時記錄保留時間和香氣特征，香氣強(qiáng)度記為0～5 六個等級，“0”表示未聞到，“3”表示該化合物香氣強(qiáng)度中等，“5”表示該化合物香氣非常強(qiáng)。每人對每個組分聞香3 次，每個化合物的香氣強(qiáng)度為6 次聞香結(jié)果的平均值。

1.2.3 GC-MS 分析

樣品通過DB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm，J＆W Scientific)色譜柱進(jìn)行分離。分離的色譜條件:氣相色譜進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣He，流速2 mL/min，進(jìn)樣量1 μL，不分流進(jìn)樣，樣品隨載氣一部分進(jìn)入檢測器，一部分進(jìn)入聞香裝置，色譜柱程序升溫程序?yàn)?50℃保持2 min，以6℃/min 速率升溫至230℃，并保持15 min。

質(zhì)譜條件:EI 電離源;電子能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃;掃描范圍:35 ～350 amu。

1.2.4 定性分析

保留指數(shù)(RI)是根據(jù)改進(jìn)的Kovats 法［17］計算得到的，在各組分中添加C5-C30 烷烴的混合標(biāo)樣，進(jìn)GC-MS 分離，通過烷烴的保留時間來計算未知物化合物的RI。通過質(zhì)譜譜庫檢索與NIST 05 a. L 庫的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖比對定性，定性結(jié)果通過計算其RI 值、香氣描述與文獻(xiàn)報道的保留指數(shù)(RI)和香氣描述比對確認(rèn)。

2 結(jié)果與討論

利用液液萃取將習(xí)酒中香氣物質(zhì)分離濃縮，并按酸堿性分離為3 個組分，其中酸性/水溶性組分的氣味為奶酪香氣中帶有醬香，中性組分香氣接近水果香、甜香，堿性組分帶有焙烤香。通過GC-O 聞香檢測到包括呋喃、吡嗪在內(nèi)的72 種香氣化合物，其中酯類12 種、醇類15 種、揮發(fā)性有機(jī)酸13 種、芳香族9種、酚類2 種、醛酮類2 種、呋喃類5 種、吡嗪和吡啶類11 種、硫化物、萜烯類化合物和未知化合物各1種。酸性組分中檢測出29 種香氣化合物，中性組分43 種，堿性組分22 種，2-戊醇、4-甲基苯酚等6 種香氣化合物在兩種組分中檢測到，1-丙醇、糠醛和β-苯乙醇等8 種香氣化合物在以上3 種組分中均可檢測到。

2.1 酸性/水溶性組分

由圖1 可以看出，習(xí)酒酸性/水溶性組分中主要有醇類、揮發(fā)性有機(jī)酸類，除此之外，還有少量的呋喃類化合物。根據(jù)香氣強(qiáng)度值(香氣強(qiáng)度≥3.5)，乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、己酸是習(xí)酒重要的揮發(fā)性有機(jī)酸，貢獻(xiàn)酸和奶酪香，是重要的香氣成分;醇類物質(zhì)貢獻(xiàn)水果香，香氣強(qiáng)度整體略小于酸類物質(zhì);酸性組分中聞到有類似醬油的氣味(RI =1 664)，但強(qiáng)度不大(香氣強(qiáng)度1.8)，持續(xù)時間非常短。

圖1 習(xí)酒酸性/水溶性組分在GC-MS 上的總離子流圖(上)及聞香強(qiáng)度圖(下)Fig.1 The total ionic chromatography (upper)and aroma intensity (under)of the volatile aroma compoundsin the acid/water-soluble fraction of Xijiu liquor

與其他香型白酒相比，醬香型白酒中揮發(fā)性有機(jī)酸的含量較高，尤其是乙酸，其在7 種醬香型白酒中的平均濃度為1.91 g/L［7］，為醬香型白酒中含量最高的揮發(fā)性有機(jī)酸。酸類在白酒風(fēng)味方面的作用主要是影響白酒的口感和后味，起到呈香、助香、減少刺激和緩沖平衡的作用［19］，主要由發(fā)酵過程中的細(xì)菌產(chǎn)生［9］。

除有機(jī)酸外，醬香型白酒中的醇類含量也很高，其中正丙醇的含量相對較高，7 種醬香型白酒中正丙醇的平均濃度為859.07 mg/L［7］，有的甚至高達(dá)2.25 g/L［20］。醇類物質(zhì)在習(xí)酒的3 個組分聞香時均能檢測到，一部分水溶性較好的醇分布在酸性/水溶性組分［12］。高級醇在白酒中不但呈香呈味，而且是醇甜和助香劑的主要物質(zhì)來源，對形成酒的風(fēng)味和促使酒體豐滿、濃厚起著重要的作用［10］。醇類主要來自于糖和氨基酸的降解［21］。

在習(xí)酒中酸性/水溶性組分中聞香檢測到的酚類主要有苯酚和4-甲基苯酚，呈現(xiàn)藥片和動物臭，這兩個化合物一般認(rèn)為是葡萄酒的異嗅化合物［22］。在白酒中，推測來源于原料稻殼中木質(zhì)素的降解［23］。

表1 醬香型習(xí)酒酸性/水溶性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 1 Important aroma compounds of Xijiu liquorin acidic/water-soluble fraction detected by Osme

2.2 中性組分

由圖2 可以看出，中性組分中檢測到的香氣化合物較多，主要有酯類、醇類、呋喃類和芳香族類化合物等。

根據(jù)香氣強(qiáng)度值，己酸乙酯(香氣強(qiáng)度=4.8)、丁酸乙酯(香氣強(qiáng)度=4.0)等是習(xí)酒重要的酯類物質(zhì)，主要貢獻(xiàn)水果香，丁酸乙酯和己酸乙酯在習(xí)酒中的含量分別為129.88 mg/L 和107.93 mg/L［20］。丁二酸二乙酯是唯一聞到的二元酸二乙酯，呈花香;2-羥基己酸乙酯是檢測到的唯一羥基酯類物質(zhì)，也呈花香。醬香型白酒中檢測到的酯的種類較多，但各酯類物質(zhì)的含量整體來說相對較少，少于藥香型酒［12］和濃香型酒［10］。大多數(shù)酯類化合物是由醇和酸在發(fā)酵和貯存過程中酯化形成的［9］。

醇類除了在酸性/水溶性組分中檢測到外，在中性組分中也有檢測到，主要貢獻(xiàn)水果香和花香。

在中性組分中檢測到8 種芳香族化合物，2-苯乙醇呈花香，香氣強(qiáng)度較高(香氣強(qiáng)度=3.5)，其在三種組分中均可以檢測到，是習(xí)酒中重要的香氣化合物，其含量為14.91 mg/L［20］。芳香族化合物可以使酒體香濃協(xié)調(diào)，主要來源于芳香族氨基酸為前體的生物分解［19］;

GC-O 檢測到的呋喃類物質(zhì)較少，主要貢獻(xiàn)花香、果香、焙烤香和青草等香氣，對習(xí)酒的風(fēng)味有著一定的貢獻(xiàn)?？啡┰卺u香型習(xí)酒中的香氣強(qiáng)度較大(≥3.0)，且在3 種組分中均可以檢測到。醬香型白酒中的糠醛含量要遠(yuǎn)高于其他香型白酒，7 種醬香型白酒中的糠醛平均含量為192.53 mg/L［7］。呋喃類化合物主要通過微生物作用或蒸餾過程中生成［24］。

在習(xí)酒中性組分中只檢測到2-庚酮和2-壬酮，主要貢獻(xiàn)水果香。醛酮類化合物主要由氨基酸脫氨脫羧、酮酸脫羧、醇氧化等化學(xué)反應(yīng)生成［19］。

二甲基三硫是本實(shí)驗(yàn)中檢測到的唯一一種含硫化合物，在習(xí)酒中的香氣強(qiáng)度較大(香氣強(qiáng)度=3.5)，其在白酒中香氣閾值極低，為0.36 μg/L［25］。二甲基三硫主要是由含硫氨基酸(蛋氨酸、胱氨酸)熱分解產(chǎn)生［26，27］。

2.3 堿性組分

由圖3 可以看出，醬香型白酒堿性組分中，香氣物質(zhì)主要是醇類和吡嗪類化合物，也有少量的芳香族化合物和呋喃類化合物。在習(xí)酒堿性組分中共檢測出10 種吡嗪類化合物，其中香氣強(qiáng)度最高的是四甲基吡嗪(香氣強(qiáng)度=4.0)，整體香氣貢獻(xiàn)較大(香氣強(qiáng)度≥3.0)的吡嗪類物質(zhì)還有2-乙基-6-甲基吡嗪、2，6-二乙基吡嗪、2，3-二甲基-5-乙基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪等。四甲基吡嗪和三甲基吡嗪是茅臺和郎酒重要的香氣化合物［6］，含量分別為230μg/L和450μg/L 左右［5］。醬香型白酒中吡嗪的種類和含量多于其他香型白酒，可能與醬香酒的“四高一長”的獨(dú)特工藝有關(guān)。吡嗪類化合物主要由微生物代謝活動或美拉德反應(yīng)生成［28－29］。

圖2 習(xí)酒中性組分在GC-MS 上的總離子流圖(上)及聞香強(qiáng)度圖(下)Fig.2 The total ionic chromatography (upper)and aroma intensity (under)of the volatile aroma compoundsin the neutral fraction of Xijiu liquor

表2 醬香型習(xí)酒中性組分香氣化合物的聞香結(jié)果Table 2 Important aroma compounds of Xijiu liquor in neutral fraction detected by Osme

續(xù)表2

圖3 習(xí)酒堿性組分在GC-MS 上的總離子流圖(上)及聞香強(qiáng)度圖(下)Fig.3 The total ionic chromatography (upper)and aromaintensity (under)of the volatile aroma compoundsin basic fraction of Xijiu liquor

3 結(jié)論

本研究采用風(fēng)味分析技術(shù)(GC-O)研究醬香型習(xí)酒。采用液液萃取對酒樣中的香氣物質(zhì)進(jìn)行濃縮，并采用分餾技術(shù)使各化合物按酸堿性分離，接著進(jìn)行聞香分析(GC-O)與質(zhì)譜分析(GC-MS)，更全面的反映樣品的信息。通過聞香分析檢測到醬香型習(xí)酒中72種香氣化合物。從化合物的種類、數(shù)量以及平均香氣強(qiáng)度值來看，揮發(fā)性有機(jī)酸、酯類、醇類是習(xí)酒的重要香氣物質(zhì);其次是呋喃類、吡嗪類化合物對習(xí)酒的香氣貢獻(xiàn)比較大，其種類和含量多于其他香型的白酒，這是醬香型白酒的一種特色;另外，芳香族類、酚類、醛酮類以及硫化物等對醬香型習(xí)酒的風(fēng)味也有著一定的貢獻(xiàn)。根據(jù)香氣強(qiáng)度值，香氣強(qiáng)度較大的物質(zhì)是己酸乙酯、丁酸乙酯、1-丙醇、3-甲基丁醇、乙酸、3-甲基丁酸、糠醛、四甲基吡嗪和二甲基三硫。當(dāng)然，對重要香氣化合物的定量檢測，并結(jié)合其在白酒中的閾值分析，將有利于更加清晰的認(rèn)識醬香型習(xí)酒。

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