膜分離技術在酶液濃縮中的應用

閔兆升，郭會明，張慶文，洪厚勝，3

1(南京工業大學理學院，江蘇 南京，210009)

2(南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京，210009)

3(南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京，210009)

酶是指從動植物和微生物體中提取的具有特殊生物催化能力的一類物質。與化學催化劑相比，酶具有高效、專一、條件溫和的催化特性，因此其被廣泛應用于食品、日化等輕工業的眾多生產領域。近幾十年，隨著酶工程技術的不斷突破和進步，酶在化工、醫藥、能源和環保等領域的應用也越來越廣泛，并引起了這些行業中的某些傳統生產工藝的變革。尤其是在生產成本的降低、商品質量的提升等方面產生了顯著的效果［1-2］。

酶制劑是指經過生物加工，能夠穩定發揮其催化作用的含有酶的制品。酶制劑的傳統生產工藝是發酵、絮凝沉淀、板框壓濾、真空干燥，尤其在酶液后處理這一生產過程中，不但存在著能耗高的問題，同時酶的活性也有很大程度的損失［3］。20 世紀60 年代發展起來的用于食品加工的新興膜分離技術有效地解決了這一問題。膜分離技術是指分子水平上不同粒徑的混合物在通過特定膜時，實現對兩組分或多組分混合的氣體或液體的選擇性分離技術。由于膜分離過程可以在常溫下進行，并且無物質相態變化，無化學變化，分離系數較大且能夠實現連續操作等優點，因此，特別適用于酶這類熱敏性物質的分離、濃縮和提純。研究證明經過超濾膜分離的酶制劑純度高，收率好，工藝流程如圖1 所示。然而，雖然利用超濾膜分離技術處理發酵酶液在市場上取得了顯著的經濟效益，但是由于膜的應用成本高、有限的膜品種與復雜的應用體系匹配度不高以及膜污染等問題的存在，使得膜分離技術在酶制劑工業化生產中得到大規模、常規化的應用受到了限制［4-7］。徐南平等［8-9］在面向應用過程的陶瓷膜制備中提出，針對不同的應用體系，應當制備不同的特定的膜材料和膜組件，以期膜分離技術在實際應用中取得優良的效果。因此，就必須對膜和膜分離有比較清楚的認知。

圖1 超濾復合工藝生產酶制劑流程圖Fig．1 The flow chart of the enzyme preparation by ultrafiltration composite technology

1 膜和膜分離

膜是膜分離技術的核心，膜的物化性質和結構不僅影響著膜分離的功能，還與膜的使用壽命有密切的關聯。

1.1 膜材料

按照制膜材料的不同，可將分離膜分為無機膜和有機高分子膜。無機膜材料多以陶瓷、金屬和金屬氧化物制成，如多孔石英玻璃、多孔陶瓷、多孔鎢(金屬薄膜)、Al2O3、TiO2、SiO2、活性炭等，其特點是物化性質穩定，耐高溫、高壓，物料通量大，是苛刻條件下較有效的分離膜。趙宜江等利用管式陶瓷膜的這種特點，采用微濾分離技術，對中藥提取液直接進行澄清處理，能夠完全除去料液中的雜質，使得后續超濾過程中，膜通量無顯著變化，單個組件的膜通量能夠穩定維持在35 ～40 L/(h·MPa)左右，極大地提高了效率，降低了能耗;但無機膜也有缺點，膜脆易碎，并且制備費用高［10-12］。有機高分子膜材料有醋酸纖維素(CA)、聚丙烯腈(PAN)、聚醚礬(PES)、聚酰胺(PA)、聚偏二氟乙烯(PVDF)等等。其特點是選擇性大、價格低廉，設備結構較為簡單。Wenzel 等發現，由于聚砜納濾膜表面帶有負電荷，正好能夠排斥帶負電荷的染料分子，對活性染料有特別高的通量和截留率，因此，它被廣泛應用于染料行業。同樣，有機膜材料也有缺點，一般來說，不耐高壓高溫，化學性質不穩定，易受微生物降解［13-15］。

1.2 膜結構

按照膜結構的不同，可分為對稱膜和非對稱膜。對稱膜又稱為均質膜，是指膜的各部分具有相同的特性，其孔結構不隨深度而變化的膜。袁權等在論述中提到，均質膜幾乎無實用性，以氣體分離膜為例，由于氣體在高分子中的滲透率過低，而為了保證均質膜在一定壓差下的強度，膜必須有一定的厚度，因此就會導致氣體通過膜的效率非常之低［16-17］。非對稱膜有一般對稱膜及復合膜2 類。其中，復合膜是指膜的表層和底層是不同材料。不對稱膜在工業上具有實用性，常見的就是超濾膜。非對稱膜的作用機理是，非對稱膜是由厚度僅為0．1 ～15 μm 的致密的表面皮層和厚度在50 ～250 μm 的呈多孔網狀結構的支撐層組成。這樣的組成結構，既能有效地截留大分子，又能降低膜的阻力，進而提高了膜通量［18-19］。

1.3 膜組件

目前常見的膜組件的形式有4 種，分別為卷式、中空纖維式、管式和板框式。卷式元件概念是1964年提出的，其結構較為復雜，類似于螺旋板式換熱器，填充面積較大，但測壓降也比較大，膜層不易污染，清洗較為方便［20］。俞三傳等［21］在膜軟化在水資源處理中的應用中提到，目前通用的軟化膜主要品種是高分子膜，常用的軟化膜元件正是卷式元件。中空纖維膜是非均向的靠自身支撐的濾膜，其優點是，可以反沖洗，使錯流過濾方式得到最大的效益，另外，中空纖維的此種形態能夠使得濾膜表面積在最小的空間得到最大［22］。劉瑩瑩等［23］在對菌糠酶提取實驗中對乙醇沉淀法、硫酸銨沉淀法及中空纖維膜過濾法3 種濃縮方式進行了比較，結果顯示，利用中空纖維膜過濾的效果最優。段學輝等［24］在耦合中空纖維膜超濾分離進行游離細胞催化合成ATP 過程的實驗研究中發現，細胞的催化效率和膜組件的操作穩定性均得到了提升，酵母細胞催化ATP 合成反應可重復使用215～310 次，酶的利用率比普通的方法提高了210 ～215倍。中空纖維膜組件的不足是，成本較高，膜層易堵塞，膜易污染，因此料液需要經過預處理;管式膜組件的優點是料液流速可調范圍大，清洗方便，缺點是單位體積膜面積較小，制作成本高。板框式膜組件，其優點是膜層不易堵塞，膜抗污染性強，膜清洗方便。缺點是料液流程短，密封難度大，只適用于實驗室選膜，難以放大到工程上去［25-27］。

1.4 膜分離過程

常見的膜分離過程包括微濾(micro filtration，MF)、超濾(ultrafiltration，UF)、納濾(nanofiltration，NF)、反滲透(reverse osmosis，RO)和電滲析(electro dialysis，ED)5 大類。表1 列出了這5 種膜分離過程的特性。其中、納濾、反滲透、電滲析膜分離技術主要用于水處理過程中。微濾及超濾技術常用于發酵行業，主要包括分離微生物、除去代謝廢物、提取濃縮產品及處理高濃度有機廢水［28-30］。

表1 常見膜分離過程特性Table 1 Common characteristic of membrane separation processes

過程 分離機制 主要分離物 膜 膜組件 膜材料反滲透(RO) 以壓力為驅動力，利用半透膜的選擇透過性。脫除水中的溶解鹽類物質，如鹽、礦物質、金屬等。復合膜 卷式、中空纖維、管式和平板式電滲析(ED)以電位差為驅動力，利用陰、陽離子交換膜的選擇透過性。脫除或富集溶液中的電解質。醋酸纖維素、聚砜、聚酰胺及其改性膜等。異相、均相及陽膜陰膜的陽、陰離子交換膜卷式和平板式聚乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯等的苯乙烯接枝聚合物。

2 酶制劑的濃縮

在酶制劑工業中，應用較多的是微濾(MF)及超濾(UF)技術，尤其以UF 使用居多。國際上從20 世紀60 年代開始采用超濾技術對酶進行濃縮提純。研究證明，此技術具有以下優點:(1)可在常溫下濃縮提純，易于實現工業上的連續生產，且避免了溫度對酶制劑質量的影響，無論是固態酶還是液態酶，其純度和收率都比較高;(2)能夠對低濃度的酶液進行有效的濃縮;(3)與真空蒸發相比，超濾技術不但能耗低而且操作簡便;(4)與傳統的鹽析及萃取法相比，可以節約成本，無需諸多無機鹽和有機溶劑的使用。而且近年來超濾技術與其他濃縮精制方法的聯合使用已越來越廣泛地被應用，并取得了一定的成效和經濟效益［31-33］。

2.1 酶液的預處理

酶液的預處理是指向酶液中加入一種或幾種物質使酶液的性質發生變化，進行預絮凝、預過濾等，以去除一些與膜相互作用的物質，從而提高膜通量。根據不同的體系應選擇不同的預處理方法，有效的預處理有助于降低膜污染，提高膜通量和膜的截留性能。目前，酶制劑絕大多數是通過微生物發酵而來，少部分是從動植物體內中提取的。由微生物發酵而來的粗酶液，其特性決定了酶發酵液中含有較多的雜質，不論是發酵時的大量菌體、細胞或細胞碎片，還是糖、無機鹽和氨基酸等參與的培養基成分。研究證明，這些物質的存在，對酶制劑的氣味、顏色及檔次等都有很大的影響，而且會對后期的膜過濾濃縮酶液產生嚴重的影響。在膜過濾前對酶液進行適當的預處理能夠有效地減輕濃差極化和膜污染程度，提高膜的使用壽命、降低生產成本。通常的預處理工藝是發酵液先經過絮凝，再用板框壓濾進行過濾。Hedda 等提出將親和吸附劑或離子交換吸附劑裝填于中空纖維超濾膜組件殼側，對發酵液進行過2 次、吸附、解析操作，從而實現酶的分離純化的理念［34-36］。Male 等［37］成功利用親和-膜過濾技術從粗尿液中分離出尿激酶，收率達到49%。這種利用膜分離的過濾方式為酶制劑除菌(除渣)的預處理工藝提供了新的途徑。

2.2 酶的濃縮及精制

用超濾技術對酶濃縮精制的目的是:(1)去除酶液中小分子不純物和鹽類;(2)實現酶液中不同分子量酶的相互分離［38］。譚晶等［39］使用內壓式聚砜中空纖維超濾膜，設計MWCO(molecular weight cut off截留分子質量)為10 kDa，膜面積為0．1 m2，研究了超濾法分離具有殼聚糖酶活力的木瓜蛋白酶的工藝操作條件，結果表明不同的跨膜壓差、濃縮倍數和操作時間對超濾分離效果是有影響大，且通過超濾法去除了原木瓜蛋白酶制劑中的大部分小分子還原糖，使得木瓜蛋白酶的純度有所提高，酶活力也提高了1．22 倍。李春艷等［40］在利用超濾法濃縮植酸酶發酵液的實驗中，采用截留分子質量為20 000 的PU-20K-PS 管式超濾膜對植酸酶發酵液進行濃縮精制處理，結果顯示，植酸酶的濃縮倍數可達6．53 倍，濃縮收率高達為99．69%，截留率甚至達到99．93%，超濾系統可以連續濃縮時長達到10 h，并且經過簡單清洗后，膜通量基本恢復。

膜通量恢復是指超濾一次后再生膜通量與超濾前膜通量的比值。超濾過程中膜通量是主要的指標，濃差極化、膜的污染等原因都會使膜通量迅速下降，甚至堵塞膜孔，所以，在生產工藝中需要選擇合適的操作條件如操作壓力、溫度、流速及濃縮倍數來減輕濃差極化和防止膜污染的產生，這樣才能保證較高的膜通量。另外，需要對設備進行定期清洗以恢復膜包的分離功能［41-42］。

2.3 膜清洗

在酶液濃縮中，即使選擇了合適的膜和適宜的操作條件，經過長期運行，膜污染現象必然發生，然而為保證生產效率就必須增加膜面積和清洗次數，但是隨之而來的就是生產成本的增加，并且多次的清洗會造成水資源的浪費以及環境的污染，同時膜的頻繁清洗會減少膜的使用壽命。因此，尋找高效的清洗方法，使膜在低成本、低污染的條件下實現再生，使膜分離技術得以工業化廣泛應用已成為亟待解決的問題。在膜清洗過程中，通常要考慮下面2 個因素:膜的化學特性及膜污染物特性。膜的化學特性是指耐酸、堿性、耐溫性、耐氧化性和耐化學試劑特性，它們對選擇化學清洗劑類型、濃度、清洗液溫度等極為重要。膜污染物特性主要是指它在不同pH 溶液中，不同濃度溶液中，不同溫度下的溶解性、電荷性、氧化性和酶解性等。這樣可選擇合適的清洗方式，從而達到最佳清洗效果。

常用的膜清洗方法包括物理清洗、化學清洗和生物清洗法3 種方法。物理方法一般是指用高流速水沖洗，海綿球機械擦洗和反洗等，它們的特點是簡單易行，但物理清洗法僅對污染初期的膜有效，嚴重污染的膜必須借助化學清洗的方法才能恢復膜通量。化學清洗通常是用化學清洗劑，循環清洗被污染的膜，然而，在選擇化學清洗時，應根據膜污染物的類型和被污染的程度以及膜的物理化學性質來慎重選擇清洗劑，以防止對膜的損害。選用酸類清洗劑，可以溶解除去無機垢;而采用NaOH 水溶液可有效地脫除油脂、蛋白質污染;螯合劑EDTA 等主要是減少膜表面及膜孔內沉積和吸附的無機污染物。生物清洗是指借助微生物、酶等具有生物活性的特性去除膜表面及內部的污染物。另外，電場過濾，脈沖清洗，脈沖電解清洗及電滲透反洗等清洗方式也具有很好效果［43-46］。

3 展望

膜分離這種新型高效的分離技術，已經得到了世界各國的普遍重視并已逐步發展成為重要的產業。膜分離技術在酶制劑中的應用既可改善酶制劑的質量，防止酶失活，提高酶的收率，又能夠節能環保、降低成本，取得了良好的效果。但是目前膜分離技術在酶制劑工業的應用還存在一些問題，新型膜材料有待開發，膜的清洗方法有待改進，絕大多數研究開發工作尚處于試驗階段，少數進入中試階段，真正的產業化應用還不多。因而面向各種過程的膜分離應用技術尚有大量的工作需要去做，如膜材質的選擇、膜的抗污染能力、膜的使用壽命等。相信隨著面向應用對象、應用過程的膜材料的設計和制備，以及我國對食品發酵工業“清潔、節能、高效”的引導，將進一步促進膜分離技術在酶制劑生產中的應用。

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