葛花粉體高效球磨制備技術及其醒酒活性測定*

許陽，杜先鋒，王一見

(安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥，230036)

葛花是古方解酒良藥［1］，其主要化學成分有黃酮類、三萜皂苷類、香豆素類、甾醇類、揮發油、生物堿和人體不能合成的必需氨基酸和無機鹽。日本學者金城順英指出，葛花中含有的皂角苷和異黃酮可以改善酒精對人體造成的新陳代謝異常［2］，從而起到解酒醒酒的作用。而葛花含有18 種異黃酮類化合物［3］，目前國內研究均注重于其中功能成分的提取和分離，但隨著目前飲酒、酗酒群體日益激增，對高效迅速的醒酒措施需求加大，而采用傳統煎煮的用藥方式可能會導致藥液中物質發生絡合、水解、氧化等反應，使功效減弱，以單一某種功能成分為目標進行提取優化則會導致其他有效組分的大量丟失，且增加成本投入，不利于資源綜合利用。本實驗旨在探究采用高效球磨技術將葛花進行精細粉碎，進而增大表面電能及其與介質的接觸面積，最大程度保留其中的功能因子，提高植物細胞中初級代謝產物和次級代謝產物的溶出速率和溶出量。

本文將采用高效球磨技術制備葛花粉體與傳統粉碎方法制備的粉體進行比較，采用瓦勒-赫霍法并稍加改良后，通過體外測定ADH 活性［4］，考察葛花粉體對ADH 活性的影響。

1 材料與儀器

1.1 原輔材料

葛花，安徽省霍山縣黃何葛業有限公司。

1.2 試劑

蘆丁標準品，中國藥品生物制品檢定所;氧化型輔酶I(NAD+)，中國醫藥集團上海化學試劑公司;乙醇脫氫酶(ADH)，Sigma 公司;其他試劑均為分析純。

1.3 實驗裝置

高效球磨機結構如圖1 所示，罐體通過彈簧伸縮變化而進行快速多維擺動式運動，使物料在罐內不規則運動產生巨大的沖擊力，延長物料的運動軌跡、提高沖擊能、減少撞擊盲點，顯著提高罐內磨介的沖擊能量和運動次數，提高了被粉碎顆粒的均勻度。與此同時，為避免罐體迅速升溫而導致物料性狀發生改變，采用罐體夾套循環水進行冷卻降溫。

圖1 高效球磨機示意圖Fig.1 Schematic diagram of high efficient ball mill

1.4 儀器

unicUV-2102C 型紫外分光光度計;PB-10 Sartorius 精密pH 計;Konica CM-3500d 臺式色差儀;Mastersizer2000 激光粒度分析儀。

2 實驗方法

2.1 植物樣品的制備

將葛花洗凈、晾干，60 ℃烘干2 h，置于干燥器內備用。

取一定量的葛花原料，用HX-200A 型高速中藥粉碎機粉碎，取100 ～150 目篩之間為葛花的常規粉體。常規粉體再經超微粉碎后，取200 ～300 目篩之間粉體為Ⅰ級粉體。再取Ⅰ級粉體經高效球磨機得到Ⅱ級粉體。

2.2 激光粒度分布測試

以空氣為分散介質，經Mastersizer2000 激光粒度分析儀進行粒徑分析。

2.3 總溶出度的測定

精密稱取葛花、常規粉體、Ⅰ級粉體、Ⅱ級粉體各5．000 0 g 于錐形瓶中，加入純水150 mL，置于(37 ±1)℃水浴加熱，分別于1、3、5、10、20、30、60 min 后過濾，取50 mL 濾液于已知恒重的鋁制稱量皿中，90℃水浴蒸干后擦去器皿外壁水分，放入(100 ±2)℃烘箱干燥1 h 后于室溫冷卻30 min，反復干燥冷卻操作，保證最后2 次重量之差小于2 mg，準確稱重(恒重)，以干燥后的恒重與稱量皿自重的差值表示總物質溶出度。每組設3 次平行樣，計算結果取平均值。

2.4 蘆丁標準曲線的制備

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 衍生體系方法［8］。

準確稱取105 ℃干燥至質量恒定的蘆丁標準品20 mg，用80%乙醇溶解，配制成0．2 mg/mL 的蘆丁標準溶液。準確吸取蘆丁標準溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 分別置于10 mL 比色管中，用80%乙醇補至5.0 mL，加入0.3 mL5%NaNO2溶液，搖勻，靜置5 min 后加入0.3 mL 10% Al(NO3)3溶液搖勻，靜置6 min 后再加入4.0 mL 4%NaOH 溶液，搖勻后純水定容至刻度線，混合均勻，于80 ℃水浴靜置10 min，冷卻至室溫后于506 nm 測定吸光度。回歸方程為Y=7.02X﹣0.019 8(X為蘆丁標品在506 nm 下的OD值)，R2=0.999 1。

2.5 總黃酮溶出量的測定

精密稱取葛花、常規粉體、Ⅰ級粉體、Ⅱ級粉體各5.0 g 于錐形瓶中，加純水150 mL 置于(37 ±1)℃水浴加熱60 min 后，過濾，取濾液2.0 mL 置于10 mL比色管中，用80%乙醇補至5.0 mL 后，按2.4 所述方法依次加入反應試劑，以不加Al(NO3)3溶液為空白對照進行測定。以80%乙醇85 ℃水浴條件下回流浸提3 次測得的總黃酮溶出量為指標考察4 種不同方法處理得到的葛花粉體對其中總黃酮溶出量的影響。

式中:c，葛花溶液總黃酮濃度(mg/mL);V，待測提取液的體積(mL);m，葛花粉體質量(g)。

2.6 不同粉體溶液色度差的測定

溶液顏色的比較使用Konica CM-3500d 進行檢測，并根據測定得出的數據(L*、a*、b*)對4 種不同粉體溶液色差進行分析比較。

2.7 乙醇脫氫酶(ADH)活力的測定

稱取10.0 g 各級粉體于溶于150 mL 純水中，于37 ℃水浴加熱90 min，取濾液50 mL，采用瓦勒-赫霍法，并稍加改良測定ADH 活力。取pH = 8.8 的Na4P2O7溶液1.5 mL 于比色管中，加入27 mmol/L 輔酶溶液(NAD+)1.0 mL，11.5%乙醇溶液0.5 mL，樣品溶液0.1 mL，混合后，于25 ℃水浴中加蓋育溫5 min 后立即加入ADH 溶液0.1 mL，混合搖勻后每隔10 s 立即測定λ =340 nm 時的吸光值，連續測定5 min。以純水代替乙醇作為參比調零，以純水代替樣品溶液測定對照組ADH 酶活。

以A340對時間作圖，取反應最初線性部分，計算A340/10 s 的增加值，根據NADH 的摩爾吸光系數κ=6．2 ×103［L/(mol·cm)］計算ADH 酶活。公式如下:

3 結果與分析

3.1 葛花Ⅱ級粉體粒度分析

由于實際顆粒的形狀通常為非球形的，難以直接用直徑表示其大小，因此在顆粒粒度測試領域，對非球形顆粒，通常以等效粒徑來表征顆粒的粒徑。如圖2 所示，激光粒度分析儀測得葛花Ⅱ級粉體粒度分布基本呈正態分布趨勢，葛花粉體粒徑范圍在4.25 ～43.74 μm，中值粒徑d(0.5)為8.08 μm，大多數高等植物細胞的直徑通常約在10 ～200 μm，可見經過高效球磨技術處理的葛花粉末已基本達到細胞破碎的水平，更有利于其胞內有效物質的釋放。

3.2 葛花粉體特性對比實驗

3.2.1 總物質溶出度比較

圖2 葛花Ⅱ級粉體粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of second grade of Flos puerariae

不同粉碎級別粉體總溶出度的測定結果見表1。表1 結果表明，各粉體的溶出度隨水浴加熱時間增加而逐漸提高，其中葛花Ⅱ級粉體均在瞬時溶出度(1 min)及后續時間段高于其他組別，葛花Ⅱ級粉體(0.182 49 g)比未處理的植物本體(0.021 45 g)高出8.6 倍，葛花Ⅱ級粉體的溶出度在20 min 后其速率趨于平緩，但較其余組別仍一直保持較高溶出量。

3.2.2 總黃酮溶出量比較

功能性因子黃酮主要存在于植物體細胞中，由纖維素和果膠構成的堅韌細胞壁會阻礙黃酮的溶出，影響其利用度。由圖3 可以看出，隨著植物粉體粒徑的不斷減小，在同溫同體積下浸提得到的黃酮，其溶出量存在明顯變化，由未處理葛花本體的2.67 mg/g 升高至Ⅱ級粉體的9.75 mg/g，與80%乙醇提取3 次得到的黃酮溶出量12.21 mg/g 比較，Ⅱ級粉體黃酮溶出含量提高57.98%。可見采用高效球磨技術，對細胞進行破壁處理，可使絕大多數的功能性成分在短時間內充分溶解于介質當中，最大程度提高其生物利用度。

表1 葛花不同粒徑粉體對總物質溶出度的影響Table 1 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on total material dissolution

圖3 葛花不同粒徑粉體對總黃酮溶出量的影響Fig.3 Effect of different particle sizes of Flos puerariae on flavone dissolution

3.2.3 葛花不同粒徑粉體溶液色度差的比較

L*是色彩的明度值，其范圍從0 到100，值為0時亮度最低，為100 時亮度最高。a*、b*值是色彩的色度值，其中a*值從紅(正值)到綠(負值)漸變，b*值則是由黃(正值)到藍(負值)漸變。

由表2 可知雖然未處理葛花溶液的亮度最高，但是色度值均低于其他組，而由葛花Ⅱ級粉體制備的溶液色度值最高，溶液的顏色最深，但是亮度卻比常規粉體和I 級粉體清亮。由3.2.1 及3.2.2 的實驗結果可知葛花Ⅱ級粉體單位時間內的釋放量及其功能因子的溶出度最好，以其溶液色度參數為標準值計算總色差，結果表明未處理的溶液顏色與標準樣差別最大，其次是常規粉體，I 級粉體溶液與標準樣最為接近，結合上述Ⅱ級粉體溶液較其他組別在總溶出度和黃酮溶出量上有明顯差異的實驗結果，在該色度差實驗中通過a*、b*值的變化得到進一步補充說明，但L*值并不隨趨勢減小，較常規粉體和Ⅰ級粉體的溶液L*值反而變大，溶液更為清亮，這提示該結果可能與采用球磨機制得Ⅱ級粉體其獨特的破壁結構和粒徑特性有關。

3.3 乙醇脫氫酶(ADH)活力的測定

乙醇進入機體后，在細胞質內經乙醇脫氫酶(ADH)氧化成乙醛，此過程是乙醇代謝的第一關卡，會消耗大量的輔酶Ⅰ(NAD+)，長期過量飲酒或一次大量飲酒會導致ADH 活性降低［9］，根據產物DADH在340 nm 處有最大吸收，且這種變化速率與ADH 活力存在一定線性關系來計算葛花不同粒徑粉體對ADH 活性的影響。

表2 不同溶液色度差的分析結果Table 2 Analysis results of colour aberrations on different solutions

測定結果見表3，比較植物經過不同粉碎處理后對ADH 活性的影響，發現Ⅱ級粉體均對ADH 激活率最高，其次是Ⅰ級粉體、常規粉體，對ADH 激活率最低的是不做任何處理的傳統植物本身，說明通過高效球磨技術處理后的植物粉體能在短時間內快速促進其功效的發揮，迅速提高ADH 的活性。

表3 葛花不同粒徑粉體對ADH 活性的影響Table 3 Effect of different particle sizes of Flos Puerariae on the activity of ADH

4 結論

通過比較葛花不同粒徑粉體的系列實驗結果可以發現，若采用傳統直接煎煮方法獲得功能成分和功效最不理想，而采用球磨技術制備的Ⅱ級粉體中值粒徑為8.08 μm(根據目數與粒徑的對應關系10 μm 對應目數為1 340 目，則8.08 μm 對應目數超過1 340目)，且粉體粉碎度均勻，也無完整的細胞結構，達到細胞級粉碎破壁水平，而且實驗結果表明植物中總溶出度、黃酮溶出量的影響均與粉體粒徑度有直接關系，粉體粒度越小，溶出時間越短。乙醇脫氫酶活性的變化影響到血中乙醇的濃度，若該酶的活力下降則導致機體中可利用的乙醇含量增加，進而加重乙醇對腦、肝臟等器官傷害作用。Yokoyama 指出ADH 在乙醇第一步的代謝中起到關鍵作用［11］，可以減少機體對乙醇的利用度，防止酒精性肝病的發生。上述實驗結果表明，葛花Ⅱ級粉體對ADH 的激活率最高，是未處理葛花激活率的2 倍，采用此高效球磨技術得到的超微粉體可達到有效成分溶出速度快、功效釋放迅速的目的。

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