固態發酵豆粕的不同生產工藝及其營養品質比較*

魏春，劉茂鋒，宣磊，汪釗

(浙江工業大學 生物與環境工程學院，浙江 杭州，310014)

飼料產品中，豆粕目前是最主要的蛋白質飼料。2012 年國內豆粕加工總量(不含進口豆粕)已達1 000 萬t 以上。為降低養殖成本，提高豆粕消化吸收率和使用效益已成為新的研究課題。豆粕發酵后，多種抗營養因子比如脲酶、胰蛋白酶抑制因子、凝血素等大大減少，可解決普通豆粕引起的仔豬腹瀉等問題［1］;另外，不容易消化的大分子蛋白減少，小肽增加，營養成分全面，可部分代替高價位的動物源蛋白質飼料［2－5］。將乳酸菌應用在豆粕發酵中還可以進一步增加發酵豆粕的益生功能、提高豆粕的使用效益，同時由于乳酸、細菌素等抑菌成分的存在，也使發酵豆粕更容易保存，可減少抗生素等化學合成藥物的使用［6－8］。

本研究選用食品安全級的米曲霉和植物乳桿菌WZ011 (Lactobacillus plantarumWZ011)為發酵菌種，組合設計了5 種固態發酵工藝，以多種指標評價這幾種工藝對發酵豆粕營養品質的影響，以期獲得最優的益生發酵豆粕生產工藝。L.plantarumWZ011 具有生產γ－氨基丁酸(GABA)能力。GABA 是一種新型飼料添加劑，攝取少量的GABA 即可增強動物的免疫性能和抗熱應激性能，促進生長［9］。

1 材料與方法

1．1 菌株

植物乳桿菌WZ011(L.plantarumWZ011)［10］，由實驗室自篩所得;米曲霉(Aspergillus oryzae)，購自上海迪發釀造生物制品有限公司。

1.2 主要試劑

分析純試劑:無水乙酸鈉、硼酸、三乙胺、OPA(鄰苯二甲醛)、茚三酮、谷氨酸鈉、乳酸、二甲基亞砜、無水乙醇等。豬胰蛋白酶(≥2 500 u/mg)、胃蛋白酶(1:3000)、牛血清蛋白、酪蛋白、酪氨酸等。豆粕來源于浙江鴻源有限公司。

1.3 種子培養基

米曲霉種子培養基PDA(g/L):土豆200，葡萄糖20，瓊脂粉20，pH 自然。

植物乳桿菌種子培養基MRS(g/L):蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，葡萄糖10，無水乙酸鈉5，檸檬酸氫二銨2，磷酸氫二鉀0.33，MnSO4·H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.02，吐溫80 1 mL，pH 6.2 ～6.4。

1.4 五種生產工藝介紹

工藝1:米曲霉單獨固態發酵。10 g 豆粕，1 g 麩皮，3.6%的硫酸銨，含水量51%，接種量36%孢子懸液，30℃間歇翻料培養36 ～48 h。

工藝2:米曲霉固態發酵后水解反應。米曲霉固態發酵后轉入55℃高溫水浴鍋中水解10 ～14 h。

工藝3:植物乳桿菌單獨固態發酵。10 g 豆粕，1 g 麩皮，3.6% 的硫酸銨，可溶性淀粉2%，含水量60%，接種量5%，30℃封口厭氧發酵60 h。

工藝4:米曲霉好氧發酵后串聯乳酸菌厭氧發酵。米曲霉固態發酵后加入可溶性淀粉2%，含水量60%，接種植物乳桿菌5%，30℃厭氧發酵60 h。

工藝5:米曲霉好氧發酵后水解再接植物乳桿菌厭氧發酵。米曲霉固態發酵后轉入55℃高溫水浴鍋中水解10 ～14 h，再加入可溶性淀粉2%，含水量60%，接種植物乳桿菌5%，30℃封口厭氧發酵60 h。

1.5 發酵豆粕各項指標檢測方法

干重的測定參考國標GM 6435 －1986。乳酸的檢測采用NaOH 滴定法。可溶性蛋白的測定參考Da Teng 等的方法［5］。溶解度(氮溶指數)的測定參考AOCSBa11 －65 的方法。小肽含量測定參考GB/T 22492 －2008 大豆肽粉國標法。游離氨基酸測定參考GB/T 8314 －2002。總氨基酸、游離總氨基酸含量測定參考GB/T 14965 －1994。豆粕還原糖測定參考DNS 法［11］。中性蛋白酶測定參考國標SBT 10317 －1999。乳酸菌活菌數測定按照稀釋涂布法稀釋一定倍數后涂布培養，48 h 后計單菌落。粗蛋白的測定參考凱氏定氮法(GB/T 6432 －1994)，利用自動定氮儀測定。脲酶含量以滴定法測定［12］，酶活定義為每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量。胰蛋白酶抑制因子的測定參考馬文強等研究者的方法［13］。GABA以HPLC 方法檢測［10］。SDS －PAGE 和蛋白質分析參考Da Teng 等研究者的方法［5］。體外消化試驗參考Da Teng 等人的方法，先用胃蛋白酶在酸性環境下37℃進行消化4 h 后再用胰蛋白酶在中性pH 環境下消化24 h，模擬動物體內胃腸道消化［5］。

2 實驗結果與討論

2.1 米曲霉固態發酵條件及水解條件的確定

5 種工藝里涉及米曲霉固態發酵、水解及植物乳桿菌發酵工藝，因此，先對米曲霉固態發酵和水解條件進行了研究，植物乳桿菌發酵條件參照已有研究結果［10］。以粗蛋白和中性蛋白酶酶活為指標進行米曲霉單獨發酵生長周期的考察。圖1 結果表明，粗蛋白在0 ～36 h 增長最快，而后幾乎無增長。中性蛋白酶酶活在0 ～36 h 也增加最快，酶活達1196.4 u/g，而后酶活略微有所下降。這些說明米曲霉在0 ～36 h時間段，尤其是在12 ～36 h 生長迅速，而后增長緩慢，主要以產孢子為主。孢子粉塵不利于加工車間的環境，也不利于消化，因此，為減少成本和不利因素，36 h 為發酵終止點。

圖1 米曲霉固態發酵中蛋白酶酶活和粗蛋白含量的時間過程曲線Fig.1 Time course of protease activity and crude protein content in solid state fermentation by Aspergillus oryzae

發酵36 h 后可能由于營養或水分不足，米曲霉生長趨于停止，大分子蛋白、抗營養因子可能還未消除完全。而米曲霉此時產中性蛋白酶酶活達1 196.4 u/g。許晶等利用堿性蛋白酶水解豆粕，獲得制備大豆肽的酶解工藝［14］，因此本實驗采用在發酵36 h 后繼續在蛋白酶最適酶解溫度55℃的環境下進行高溫水解的方法，以進一步水解蛋白質。

圖2 發酵豆粕水解過程中可溶性蛋白和游離氨基酸含量的時間變化曲線Fig.2 Time course of soluble protein and free amino acid content during the hydrolysis of soybean meal after fermentation

由圖2 可見，繼續水解可顯著提高可溶性蛋白和游離氨基酸含量，在0 ～10 h 提高量最大，可溶性蛋白含量提高27.55%，游離氨基酸含量提高43.53%，而后提高不明顯。因此選用10 h 為水解終點。

2.2 發酵豆粕主要營養指標比較和分析

2.2.1 營養指標總體比較

通過各指標的結果可以發現，5 種工藝中，工藝3的豆粕營養指標最差，說明植物乳桿菌單獨發酵會消耗部分酸溶性蛋白和小肽。工藝2 的豆粕酸溶性蛋白、氮溶指數、小肽增加最多，分別為9.73 倍、25.1%、10.94 倍。這3 項同時表明了在米曲霉發酵后進一步水解，酸溶性蛋白、氮溶指數以及小肽具有明顯的提高，這些都明顯改善了大豆蛋白營養及在動物體內的消化吸收［15－16］。水解后還原糖比水解前提高了34.92%，說明55℃水解也有助于纖維素酶、淀粉酶水解更多的多糖成還原糖，更易消化吸收。與植物乳桿菌串聯發酵后的工藝四，其大部分營養指標均優于工藝五。在植物乳桿菌活菌數和GABA 含量上，工藝4 比工藝5 分別高69.3%和352%。

表1 五種工藝對應的發酵豆粕營養指標比較Table 1 Comparison of nutrition index of fermented soybean meals with five different production technology

表2 六種豆粕飼料氨基酸含量分布Table 2 Amino acid composition of six kinds of soybean meals

此植物乳桿菌在最優條件下液態培養時可產GABA 達5.8 g/L［10］。雖然本研究中植物乳桿菌WZ011 生產GABA 并不在最優條件下，工藝4 豆粕中測得的GABA 含量相對液態發酵含量較低，但說明該菌株在固態發酵中也具有產GABA 的能力。范志勇等人報道，在生長豬日糧中添加GABA(50、100 mg/kg)，可顯著提高生長激素、促黑激素、促甲狀腺激素(TSH)的分泌水平，對動物激素具有積極的調節作用［17］。工藝4 所得豆粕的GABA 含量達371 mg/kg，完全可以滿足豬對GABA 的少量需求，因此該飼料具有比一般乳酸菌發酵飼料更全面的促生長功效。

脲酶在國家飼料標準中規定不得大于0.4 mg/g. min，工藝4 脲酶酶活已減少到無法檢出，同時其胰蛋白酶抑制因子消除率也最高，達91.8%。胰蛋白酶抑制因子本質上是水溶性球蛋白［18］，因此工藝4中高的胰蛋白酶抑制因子消除率可能是植物乳桿菌發酵過程中的蛋白酶進一步降解所致。

2.2.2 游離氨基酸含量分布比較

表2 結果表明，除了工藝3 總氨基酸含量降低以外，其他類型豆粕飼料的總氨基酸含量都有所增加。其中工藝2 增加最多，達25.3%，其必需氨基酸含量也增加最多，達26.04%。必需氨基酸含量增加，說明豆粕在進一步降解的條件下，必需氨基酸比例有增加的趨勢。在各種氨基酸中，組氨酸含量增加最多，達105.5%。組氨酸對成年動物而言，是一種非必需氨基酸，但對幼齡動物卻是必需氨基酸。工藝2 中組氨酸含量的增加，對于喂養幼齡動物更具優勢。賴氨酸作為豆粕飼料中第1 限制性氨基酸，顯著影響著動物的代謝和生長，其含量在工藝1、工藝2、工藝4 豆粕中較原豆粕分別增加9.3%、11.8%、7.9%。因此用于豬特別是乳豬的飼料中，工藝2 豆粕的氨基酸營養價值最高。

2.2.3 可溶性蛋白質的SDS-PAGE 分析

各種發酵工藝對豆粕蛋白質分子量的影響如圖3 所示。分子量＞45 kDa 定為大分子蛋白質，分子質量在15 ～45 kDa 定為中分子量蛋白質，分子質量＜15 kDa 定為小分子蛋白質。通過軟件GlyKo Band-Scan (Version 5.0)分析各條帶的濃度比例［5］，結果如表3。

圖3 各種豆粕飼料的蛋白質電泳結果圖Fig.3 SDS-PAGE diagram of the protein composition for different soybean meal feedingstuffs

表3 各種豆粕飼料中蛋白質分子質量分布Table 3 Molecular weight distribution of the proteins from different soybean meal feedingstuffs

圖3 和表3 表明，經過米曲霉發酵的豆粕(Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ)，其大分子蛋白得到了有效地降解，主要的抗原蛋白β－伴球蛋白基本被消除，蛋白質主要集中在20 kDa 以下。而只有植物乳桿菌發酵的豆粕(Ⅱ)，其蛋白質幾乎沒有被降解。和米曲霉單獨發酵相比較，工藝2 對豆粕中球蛋白β 亞基(50 kDa 左右)的消除更徹底，表明水解10 h 比繼續發酵10 h更有利于蛋白酶參與的降解。米曲霉發酵后串聯植物乳桿菌發酵所得的豆粕蛋白(第Ⅲ組)分子量明顯比米曲霉發酵后水解再加植物乳桿菌發酵(Ⅳ組)的更低。分析原因可能是:米曲霉發酵后不經水解步驟直接加植物乳桿菌發酵，米曲霉自溶現象不明顯，其蛋白酶在后續發酵過程中仍會繼續少量分泌，從而有利于降解生成更多的小分子蛋白［19］，而采用高溫水解之后的米曲霉自溶嚴重，其蛋白酶停止分泌，不再增加，同時菌體內的一些高分子量蛋白質釋放至培養基中，導致小分子量蛋白的比例減少。

2.3 五種工藝發酵豆粕和原豆粕的體外消化

體外消化率結果如圖4 所示，其中工藝4(米曲霉發酵后直接串聯植物乳桿菌厭氧發酵豆粕)的消化率最高，達到96.8%，高于Da Teng 等人研究的最高消化率(85.36%)［5］。結果表明，米曲霉有氧發酵后與植物乳桿菌串聯進行厭氧發酵的工藝使得豆粕中的蛋白質更容易被消化。

圖4 六種豆粕飼料體外消化率Fig.4 In vitro digestibility of six kinds of soybean meal feedingstuffs

3 結論

(1)單菌發酵工藝結果的比較分析表明，經米曲霉發酵后55℃水解的豆粕營養品質要優于米曲霉單獨發酵和植物乳桿菌單獨發酵，各種蛋白質、小肽、氨基酸含量都高于無水解步驟的單菌發酵，更易于消化吸收，同時脲酶和胰蛋白酶抑制因子等抗營養因子含量更低。單菌發酵結合高溫水解有利于營養指標的改善。

(2)雙菌串聯發酵工藝結果的比較分析表明，米曲霉有氧發酵36 h 后直接串聯植物乳桿菌厭氧發酵(工藝4)所獲豆粕在營養品質上優于中間加高溫水解步驟工藝(工藝5)所獲的豆粕，也優于單菌發酵的豆粕和原豆粕。在本研究中，高溫水解在雙菌串聯發酵中并不能提高其營養價值。

(3)工藝4 的發酵豆粕在營養指標上除了常規成分外，還含有乳酸4.95%，GABA 0.317 mg/g，植物乳桿菌活菌數1.93 ×1010CFU/g，。發酵產品具酸香味，體外消化率達96.8%。

該雙菌串聯固態發酵工藝簡單可行且綠色環保，所產豆粕的營養價值高、富含益生菌及益生素，可以減少抗生素和防腐劑的使用，在飼料行業和養殖業具有應用意義。

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