王瑜，周春生，劉書云，田然，田雨，姜瞻梅

(東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱，150030)

糖基化反應，是一種氨基化合物和羰基化合物之間發(fā)生的非酶褐變反應，與化學修飾相比較，糖基化反應為食品和藥品系統(tǒng)提供了更安全的接枝物，這種酶法修飾蛋白質可以用于改善蛋白質的穩(wěn)定性、乳化性、溶解性［1］。Jimenez-Castano［2］等將葡聚糖引入到β-乳球蛋白中可改善β-乳球蛋白的溶解性和熱穩(wěn)定性;Chevalier［3］等將乳糖引入到β-乳球蛋白中可提高乳清蛋白的起泡性;Li［4］等發(fā)現(xiàn)，乳清蛋白麥芽糖的糖基化產(chǎn)物具有顯著的凝膠形成特性。

菊粉是由D-果糖經(jīng)β(1-2)糖苷鍵連接而成的鏈狀多糖，是一種非消化性的碳水化合物，含有大量游離氨基，它不僅能夠改善食品質構，提高流變學性質和營養(yǎng)特性，而且可以作為氨基的供應體與還原糖發(fā)生糖基化反應，對于菊粉糖基化反應的研究目前集中在乳化性方面［5］，而抗氧化性方面的研究較少。本研究擬利用糖基化修飾技術，以乳清蛋白和菊粉為研究對象，制備乳清蛋白菊粉糖基化復合物，探討糖基化反應條件對乳清蛋白菊粉糖基化復合物的褐變特性與抗氧化性能的影響，為拓展糖基化蛋白改性和提供天然的抗氧化劑提供基本技術依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳清蛋白分離物(WPI)，北京Milky Way 商業(yè)公司;菊粉，定西市隴海乳品有限責任公司;2，2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH)，美國sigma公司;鐵氰化鉀，天津市博迪化工有限公司;過硫酸鉀，天津市凱通化學試劑有限公司;三氯化鐵，天津市雙船化學試劑廠;三氯乙酸，上海凌峰化學試劑有限公司。

pH 計，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;GL-21M 離心機，上海市離心機械研究所;精密電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UT-1800 紫外-可見分光光度計，日本島津公司;DK-8B 電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司;KQ3200DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司;電子恒溫油浴鍋，江蘇金壇市億通電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳清蛋白糖基化復合物的制備

將乳清蛋白與菊粉按照一定的比例混合、溶解，在一定溫度和pH 值下于具塞離心管中油浴反應，并測定反應后pH 值，反應產(chǎn)物在－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 褐變程度的測定

參考Ajandouz［6］等人的方法，并稍作修改。將不同濕熱反應條件下制備的樣品用蒸餾水稀釋4 倍，在420 nm 處測定其吸光值變化。

1.2.3 DPPH·清除能力的測定

參考Saiga［7］的方法，并稍作修改。取稀釋4 倍的樣品液1.0 mL(0.01 mol/L pH 值為7 的磷酸鹽緩沖液稀釋)及4.0 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液(體積分數(shù)為95%)，混合均勻，室溫下避光靜置0.5 h，用體積分數(shù)95%的乙醇溶液作參比，在517 nm 測定吸光度Ai，95%的乙醇代替樣品溶液，得吸光度Ac，95%的乙醇代替DPPH 溶液，得吸光度Aj。

1.2.4 還原能力測定

參考Oyaizu［8］的方法，并稍作修改。取0.5 mL的2 倍稀釋樣品(0.01 mol/L pH 值為7 的磷酸鹽緩沖液稀釋)，加入2.5 mL 的0.2 mol/L，pH 值為6.6的磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 的1%的K3Fe(CN)6溶液混合均勻，將混合物于50℃下保溫20 min 后快速冷卻，再加入2.5 mL 的10%的三氯乙酸溶液，混勻后再3 000 r/min 離心10 min。取2.5 mL 上清液，加入2.5 mL 的蒸餾水和0.5 mL 的0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，靜置10 min 后，在700 nm 處測定吸光值。

1.2.5 實驗設計

分別研究不同反應物濃度(2%、4%、6%、8%、10%)，反應溫度(80℃、90℃、100℃、105℃、110℃)，反應起始pH 值(7、8、9、10、11、12)對乳清蛋白糖基化復合物的褐變特性與抗氧化活性的影響，并對乳清蛋白糖基化反應條件進行優(yōu)化。

1.2.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS17.0 軟件，進行方差分析(Dundan 多重比較)和獨立樣本T 檢驗，數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示(n=4)。

2 結果與討論

2.1 反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.1.1 反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響

棕褐色的生成(420 nm)是最容易衡量的糖基化反應的結果，因為它提供了一個可視化估計(Morales＆ Jimenez-Perez，2001)［9］。420 nm 處的吸光值在一定程度上反映了糖基化反應程度的大小，吸光值越大，說明其反應程度越大，反之則較小。將乳清蛋白與菊粉按1 ∶1 配制成2%、4%、6%、8%、10%的溶液，在100℃，起始反應pH 值9 條件下反應6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復合物。反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度影響的實驗結果見圖1。

圖1 反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響Fig.1 The effect of reactant concentration on browning intensity of glycosylated WPI

從圖1 的T 檢驗結果可知，糖基化乳清蛋白與單獨加熱的乳清蛋白相比，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)，這說明糖基化反應可使乳清蛋白發(fā)生褐變反應，色澤變深。由方差分析的試驗結果可知，單獨加熱后的乳清蛋白和糖基化乳清蛋白的褐變強度，隨反應物濃度增加，逐漸增大(P＜0.05)，這表明增加反應物濃度，可增強乳清蛋白糖基化復合物褐變程度。

2.1.2 反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響

本文評價乳清蛋白糖基化復合物的抗氧化活性，主要包括DPPH 自由基清除能力和還原能力的兩個方面。反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響試驗結果見表1。

表1 反應物濃度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響Table 1 The effect of reactant concentration on antioxidant property of glycosylated WPI

從表1 中T 檢驗試驗結果可知，與單獨加熱乳清蛋白相比，當反應物濃度為6%、8%、10%時，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的DPPH 自由基清除能力和還原能力顯著增強(P＜0.05)。

由表1 中方差分析試驗結果可知，單獨加熱乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力隨著反應物濃度的增加，略微增大;然而，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的DPPH 自由基清除能力，隨著反應物物濃度增加，其顯著增大(P＜0.05)。當反應物濃度為10%時，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的DPPH·清除率是反應物濃度為2%時的4.5 倍，遠遠高于單獨加熱乳清蛋白的自由基清除能力。這可能是糖基化蛋白可通過提供氫，使得DPPH·形成穩(wěn)定的DPPH-H 分子，從而達到清除DPPH·的目的(Matthaus)［10］。由此，可推斷乳清蛋白菊粉糖基化復合物能夠有效的為自由基提供氫，是自由基抑制劑，可以作為抗氧化劑。

單獨加熱乳清蛋白的還原能力變化差異不顯著(P＞0.05)，而乳清蛋白菊粉糖基化復合物的還原能力隨著反應物濃度升高，其顯著增大(P＜0.05)。反應物濃度為10%時的乳清蛋白菊粉糖基化復合物的還原能力是反應物濃度為2%的3 倍。

綜合上述結果表明，增加反應物濃度可有效提高乳清蛋白糖基化復合物的抗氧化活性。

2.2 溫度對乳清蛋白糖基化復合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.2.1 溫度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響

在糖基化反應中，溫度相差10℃，褐變速度就可相差3 ～5 倍。將乳清蛋白與菊粉按1∶1 比例配制成6%的溶液，調節(jié)起始反應pH 值為9，分別在80℃、90℃、100℃、105℃、110℃條件下反應6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復合物。反應溫度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度影響的試驗結果見圖2。

圖2 溫度對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響Fig.2 The effect of temperature on browning intensity of glycosylated WPI

從圖2 的T 檢驗結果可知，不同反應溫度條件下的糖基化乳清蛋白與單獨加熱的乳清蛋白相比，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)。從圖2 中方差分析的試驗結果可知，單獨加熱后的乳清蛋白和糖基化乳清蛋白在420 nm 處的吸光值，隨著反應溫度升高而緩慢增加(P＞0.05)，可能是由于溫度的升高，可促進羰氨縮合反應，使得生成的褐色物質增加，但由于多糖反應較慢，只有較少量的中間產(chǎn)物形成了褐色物質，這表明升高反應溫度可增強糖基化反應的褐變程度，但影響程度較小。

2.2.2 溫度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響

溫度是糖基化反應的重要影響因素，可以影響還原酮，類黑精等抗氧化物質的生成。溫度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性影響的試驗結果見表2。

表2 溫度對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響Table 2 The effect of temperature on antioxidant property of glycosylated WPI

從表2 中T 檢驗試驗結果可知，與單獨加熱乳清蛋白相比，當溫度超過100℃后，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的DPPH 自由基清除能力及還原能力顯著增強(P＜0.05)。

由表2 中方差分析試驗結果可知，糖基化乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力隨溫度升高呈上升趨勢，在90℃時顯著增強(P＜0.05)，單獨加熱乳清蛋白的DPPH 自由基清除能力在90℃、105℃時顯著增強(P＜0.05)，這與Manzocco 等在許多反應模式中發(fā)現(xiàn)的反應溫度與抗氧化性呈現(xiàn)正相關的研究結果一致［11］。

乳清蛋白菊粉糖基化復合物的還原能力隨溫度升高而緩慢增加(P＜0.05)，而單獨加熱乳清蛋白的還原能力對不同反應溫度變化，其差異不顯著(P＞0.05)。這可能是因為提高反應溫度可以促進糖基化反應產(chǎn)生還原酮和一系列雜環(huán)化合物，還原酮物質具有還原和螯合作用，雜環(huán)類化合物之間具有相互締合和協(xié)同作用，這對抗氧化活性有很大的作用。

綜合所述可知，升高反應溫度，可以提高乳清蛋白菊粉糖基化復合物的抗氧化性。

2.3 起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物的褐變特性與抗氧化活性的影響

2.3.1 起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響

較高起始反應pH 值有助乳清蛋白與菊粉發(fā)生糖基化反應，導致褐變。將乳清蛋白與菊粉按1:1 比例配制成6%的溶液，分別調節(jié)起始反應pH 值為7、8、9、10、11、12，在100℃下反應6 h，制得乳清蛋白菊粉糖基化復合物。起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度影響的試驗結果見圖3。

從圖3 的T 檢驗結果可知，糖基化乳清蛋白與單獨加熱乳清蛋白相比，除起始反應pH 值8 以外，420 nm 處吸光值差異顯著(P＜0.05)，說明不同反應條件下的糖基化反應，對乳清蛋白褐變程度影響較大。同時，由方差分析的試驗結果可知，單獨加熱乳清蛋白，在起始反應pH 值8 ～11 范圍內，420 nm 處的吸光值差異不顯著(P＞0.05);糖基化乳清蛋白，隨起始反應pH 值的升高逐漸增大，在起始反應pH 值為10、11、12 時，420 nm 處的吸光值差異顯著(P＜0.05)，由此可知，堿性條件有利于糖基化反應的進行，這與Moreno 等在葡萄糖—賴氨酸體系中發(fā)現(xiàn)的結果一致［12］。

圖3 起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物褐變程度的影響Fig.3 The effect of initial pH on browning intensity of glycosylated WPI

2.3.2 起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響

褐色素的形成和抗氧化活性有很大的關聯(lián)，因此，起始反應pH 值會對糖基化蛋白的抗氧化活性產(chǎn)生影響。起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響試驗結果見表3。

表3 起始反應pH 值對乳清蛋白糖基化復合物抗氧化活性的影響Table 3 The effect of initial pH on antioxidant property of glycosylated WPI

從表3 中T 檢驗試驗結果可知，當起始反應pH值7 ～10 范圍內，與單獨加熱乳清蛋白相比，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的DPPH 自由基清除能力顯著增強(P＜0.05);在起始反應pH 值7 ～12 范圍內，乳清蛋白菊粉糖基化復合物的還原能力顯著增強(P＜0.05)。

由表3 中方差分析試驗結果可知，單獨加熱乳清蛋白和乳清蛋白菊粉糖基化蛋白的DPPH 自由基清除能力，呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。這可能由于氨基酸是兩性分子，它在堿性介質中呈陰離子，此時，氨基反應性較強，易發(fā)生反應，因此起始反應pH 值偏向堿性有利于糖基化反應的進行，但是堿性過強，蛋白質的一級結構可能發(fā)生變化，如脫氨、脫羧和肽鍵斷裂，引起“胱賴反應”，將氨基酸轉變成有毒的化合物，反而不利于糖基化反應的進行。

在起始反應pH10 ～12，單獨加熱乳清蛋白的還原能力逐漸增大(P＜0.05)，而糖基化乳清蛋白的還原能力，隨著起始反應pH 值增大而顯著增強(P＜0.05)。起始反應pH 值為7 時，糖基化乳清蛋白的還原能力最低，可能由于還原酮及裂變產(chǎn)物在較高的pH 值條件下更容易形成［13］。

3 結論

在乳清蛋白糖基化反應過程中，反應物濃度越大，反應溫度越高，乳清蛋白菊粉糖基化產(chǎn)物的褐變強度越大，抗氧化活性越強;起始反應pH 值越大，乳清蛋白菊粉糖基化產(chǎn)物的褐變強度及還原能力越強，而其DPPH 自由基清除能力呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。當反應物濃度為6%，溫度為100℃，起始反應pH 值為9 時，所獲得的乳清蛋白糖基化產(chǎn)物抗氧化活性較強。乳清蛋白與菊粉的糖基化反應是一種具有應用前景的改善乳清蛋白抗氧化活性的方法，其糖基化產(chǎn)物可以作為一種天然抗氧化劑應用于食品工業(yè)中。

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