蠟樣芽胞桿菌生長/非生長界面模型的建立和評價*

陳琛，楊憲時，李學英

1(中國水產科學研究院東海水產研究所，上海，200090) 2(上海海洋大學食品學院，上海，201306)

預測微生物學是運用微生物學、工程數學以及統計學進行數學建模，利用所建模型，通過計算機及其配套軟件在沒有進行微生物檢測的情況下快速有效地預測微生物的生長與死亡規律［1］。預測微生物學的核心是數學模型的建立，預測數學模型可分為動力學模型和概率模型、經驗模型和理論模型、初級模型、二級模型和三級模型等［2］。自20 世紀90 年代以來，動力學模型一直為預測微生物學的研究重心［3］。雖然這類模型能夠描述微生物生長與環境因子之間的數量關系，預測食品的貨架期，但是它只能描述微生物的生長情況，卻不能表述微生物的非生長情況。而概率模型既可以描述微生物生長情況也可以描述微生物的非生長情況［4］。與腐敗菌達到一定數量食品才會出現問題不同，致病菌處于任何生長期都有引起中毒的潛在危險，對于含有潛在致病菌和產毒素菌株的食品來說，描述其生長/非生長情況比描述其生長速率更有意義。

蠟樣芽胞桿菌是條件致病菌，由蠟樣芽胞桿菌引起的食物中毒居細菌性中毒的第4 位，且有增長的趨勢［5］。最常見的是通過產生腹瀉毒素和嘔吐毒素導致食物中毒。Andersson A 等人［6］指出當食品中蠟狀芽胞桿菌數＞103 cfu/g 時，對消費者即產生潛在的危害。軟烤蝦仁是一種高水分的烤蝦制品，屬于溫和加工類制品。由于加工條件溫和，耐高溫的蠟樣芽胞桿菌很可能殘存下來，實驗證明蠟樣芽胞桿菌是軟烤蝦仁產品的主要變質菌［7］。因此以軟烤蝦仁為原料，研究并建立產品中蠟樣芽孢桿菌在不同柵欄因子作用下的生長/非生長模型，為抑制蠟樣芽孢桿菌生長，進一步優化生產條件提供參考。

本文旨在運用logistic 回歸模型建立純培養基下蠟樣芽胞桿菌在溫度、水分活度和pH 環境因子協同作用下的生長/非生長界面模型。為軟烤蝦仁產品中蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長界面模型的建立提供了方法性參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

菌株:蠟狀芽胞桿菌菌株分離自貯藏后期的高水分軟烤蝦仁。菌株分離與鑒定方法參見GB/T 4789.14 －2003 和文獻［8－10］. 將分離的蠟狀芽胞桿菌菌株接種到無菌TSB 液體培養基中，加入無菌甘油混勻，置于－70 ℃冰箱中保藏備用。高水分軟烤蝦仁由浙江省舟山市越洋食品有限公司提供。

1.2 儀器與試劑

Sanyo MIR 153、253 高精度培養箱，日本;OLYMPUS CX41 電子光學顯微鏡，日本OLYMPUS 公司;SA-960-II SHJ-系列凈化工作臺，上海凈化設備廠;Power wave XS 酶標儀，美國Bioteck 公司;IUL 均質器，上海德記行科技發展有限公司;電熱恒溫水浴鍋DK-S24，上海精宏實驗設備有限公司;pHS-2C 型酸度計，上海偉業儀器廠;LabMASTER-aw 型水分活度儀 瑞士Novasina 公司;Sensitire Automated Microbiology System 微生物鑒定和藥敏分析儀，英國TECK Diagnostic Systems 公司。

腦心浸液肉湯培養基(BHI)，購買于英國OXOID公司;胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)和胰蛋白大豆瓊脂(TSA)，購買于北京陸橋;NaCl、NaOH、KH2PO4、HCl，均為國產分析純，上海國藥化學試劑公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌懸液的準備

菌株采取斜面低溫保藏法［11］于4 ℃冰箱中保藏。每月移種1 次，實驗前無菌挑取1 環斜面保藏菌株接種到裝有10 mL 無菌BHI 肉湯培養基的試管中，置于37 ℃培養，培養24 h 之后從該試管中無菌吸取1 mL 培養液接種于裝有9 mL 無菌BHI 肉湯培養基中置于37 ℃培養18 h，以使菌株達到生長穩定期，菌懸液備用。

1.3.2 蠟樣芽胞桿菌生長最低溫度(Tmin) 、最低水分活度(Awmin) 和最小pH 值( pHmin) 的確定

Tmin的確定:添加甘油調節BHI 培養基的Aw值為0.99，并用1 mol/L 的HCl 調節培養基的pH 值為6.5。將調節好的培養基分裝到若干試管后滅菌，待滅菌后測定其最終的Aw值和pH 值。將上述培養基無菌操作移取到7 個滅菌96 孔板里，每個小孔分裝200 μL，分別做4 個平行。將菌懸液適當稀釋到103cfu/mL 數量級，分別吸取50 μL 到上述的小孔中，然后滴加50 μL 的無菌石蠟油并蓋上無菌塑料蓋，分別置于15，20，25，30，35，40 ℃恒溫箱中培養［12－13］。每小時取出培養板放入微孔板掃描分光光度計中讀取各孔在光波長600 nm 下的OD值。測繪不同溫度下的蠟樣芽胞桿菌的生長曲線，并計算出相應的蠟樣芽胞桿菌的生長速率(μmax)［14］。最小的Tmin通過Ratkowski 等人［15］提出的二級模型的外推回歸線與溫度軸相交而得到。該模型描述了微生物生長速率與溫度之間的關系，具體模型如下:

式中r=μmax=△OD/h ，即微生物指數期的生長速率;Tmin為假設的概念，指的是微生物沒有代謝活動時的溫度(℃);Tmax是允許微生物生長的最高溫度(℃);T為設定溫度(℃);b是對于溫度低于微生物生長最優溫度時的回歸參數對于溫度高于微生物最優生長溫度的附加參數。

Awmin的確定:調節BHI 肉湯培養基的水分活度分別為0.94，0.95，0.96，0.97，0.98 和0.99。然后將各培養基的pH 值用HCl 調節到6.5 后滅菌。待其滅菌后測定其培養基的最終水分活度和pH 值。將上述培養基各取200 μL 無菌操作滴加于滅菌96 孔板里，每組做4 個平行。菌液的接種和培養板的液封同上述操作，最后將96 孔板置于37 ℃恒溫箱中培養［16］。每小時取出培養板放入微孔板掃描分光光度計讀取菌OD值。最小水分活度根據McMeekin［17］等人提出的二級模型求得，該模型描述了微生物的生長速率與溫度，pH 和水分活度之間的關系，其中模型如下:

式中，pHmin是理論上允許微生物生長的最低pH;AW是設定的水分活度;Awmin為理論上允許微生物生長的最低水分活度;r、b見式(1)。

pHmin的確定:測定及計算方法同Awmin的確定方法。

1.3.3 實驗設計

為了更全面地描述蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長界面，本實驗采用全因子設計方案。因子和水平的選擇主要基于前期實驗的單因素實驗以及一些學者的報道［18－19］。選擇溫度、水分活度和pH 值3 個因素，溫度選擇10，15，20，25，30，35 ℃6 個水平，水分活度選擇0.992，0.983，0.975，0.965，0.96，0.95，0.942，0.936 8 個水平，pH 值選擇5，5.5，6，6.5，7，7.5 6 個水平進行全因子實驗。

1.3.4 生長/非生長實驗

根據全因子實驗的設計，配制相應條件的BHI肉湯培養基，然后將各培養基分裝到若干個試管中，滅菌。將菌懸液適當稀釋到103CFU/mL 數量級，蠟樣芽胞桿菌的初始接種量通過傾注TSA 平板計算菌落總數求得，然后取1 mL 接種到裝有9 mL 培養基的試管中，振蕩混勻后放入相應溫度的恒溫培養箱中培養48 h，每組實驗作2 個平行。培養結束后觀察各試管的混濁度。如果試管中菌液渾濁明顯且具有蠟樣芽胞桿菌在肉湯培養基中的生長特性，便確定蠟樣芽胞桿菌已經生長，并記為1，對于菌液渾濁度不明顯或者有質疑的試管，則通過對該試管進行涂布確認，如果有雜菌落出現，則表示該試管有污染，重新測定。反之保留該數據。最后通過比較初始的菌落總數與48 h 后的菌落總數來確定蠟樣芽胞桿菌是否生長，如果最終的菌量比初始接種量多于0.5 lg CFU/mL［20］，則判定蠟樣芽胞桿菌生長，并記為1，否則記為0。

1.3.5 模型的建立和檢驗

采用logistic 回歸模型來擬合實驗數據，分析方法通過R 軟件的GLM 函數實現。該模型是由Ratowsky［5］等人通過微生物生長動力學模型修正而來，此模型為概率模型，通過似然比卡方統計量來檢驗模型的擬合效果。該模型描述了微生物的生長概率與不同的培養溫度，培養基的pH，水分活度之間的關系，具體模型如下:

式中logit(p)=ln［p/(1 －p)］，p為微生物生長概率，p∈(0，1);bi為模型擬合參數;T為微生物培養溫度;Tmin為允許微生物生長的最低溫度;pH 為培養基的pH，pHmin為允許微生物生長的最低pH;aw為培養基水分活度;awmin為允許微生物生長的最低生長溫度。

為了更好地闡述該回歸模型在描述蠟樣芽胞桿菌的生長非生長界面的生物學意義，令P=0.1、0.5、0.9 并用Microsoft Excel Solver 來計算這3 種情況下生長非生長界面上的預測T、pH 值和Aw值。并用Matlab 繪制出P=0.1、0.5、0.9 條件下生長非生長的預測界面。

2 結果與分析

2.1 Tmin、Awmin和pHmin的確定

由式(1)、式(2)可以計算出在BHI 肉湯培養基中允許蠟樣芽胞桿菌生長的最小溫度Tmin=9.99℃，最小水分活度Awmin=0.931 以及最小pH 值pHmin=4.5。該結果與Lanciotti Rosalba［18］等人曾報道的結果不同，可能是不同菌株間的特性差異從而導致對生長環境敏感度的差異。微生物的最低生長溫度是一個理論值，它是通過方程外推回歸線和溫度軸相交得到。據相關報道蠟樣芽胞桿菌最適生長溫度為30 ～37 ℃，不同來源的蠟樣芽胞桿菌的最低生長溫度也不完全相同，有些甚至低至4 ～5 ℃，從乳制品中分離出來的蠟樣芽胞桿菌一般都能在較低的溫度下生長［5，19］。除了培養溫度，水分活度的大小和培養基類型也對微生物的生長造成很大影響。微生物的最小水分活度也會因不同菌株和環境因素的不同而略有不同，例如Santos［21］等人曾報道嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)的最小水分活度值會因不同的菌株，培養溫度和培養基類型的影響從0.940 ～0.973之間變化不等。本實驗通過添加甘油來調節養基的水分活度，也有學者通過添加NaCl 和糖來調節［22］，但當液體培養基中的NaCl 和糖達到一定量會形成高滲透壓，本身對細菌有著一定的抑制，而甘油能夠迅速地滲透到微生物細胞中去，因此本身對細菌的抑制作用較弱。所以甘油對實驗的干擾性較小，微生物也能在較低的水分活度下生長［23］。

3.2 生長/非生長模型的建立以及數據分析

不同生長溫度，水分活度和pH 條件下蠟樣芽胞桿菌在BHI 肉湯培養基中的生長/非生長情況的部分結果見表1。從所選的數據可以看出蠟樣芽胞桿菌在15 ℃出現生長情況較少，溫度越低則出現生長情況越少，水分活度越高則出現的生長情況越多;pH為6.5 時，蠟樣芽胞桿菌生長較旺盛，pH 為7.5 時，生長的情況等于非生長情況，而pH 為5.5 時，不生長的情況多于生長情況。因此可以看出偏中酸性的環境更利于該菌株的生長。從所選數據可以得出蠟樣芽胞桿菌對溫度，pH 和水分活度的交互影響較為明顯。當水分活度達到0.965，溫度為25 ℃，pH 為5.5 時，蠟樣芽胞桿菌不生長，而保持水分活度，溫度不變，pH 為6.5 時，蠟樣芽胞桿菌則生長;當保持溫度，pH 值不變，水分活度為0.975 時，則蠟樣芽胞桿菌出現生長。

表1 不同Aw、pH 和溫度條件下蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長情況的部分結果Table 1 Some results of the growth/no growth condions for Bacillus cereus in different Aw，pH and temperature

logistic 回歸模型擬合結果見表2。z 檢驗結果顯示，模型參數的P值均小于0.000 1，表明各因素擬合結果高度顯著，結合卡方檢驗分析，模型擬合效果達到極顯著水平。

表2 logistic 回歸模型擬合結果Table 2 The results equations obtained by fitting the logistic regression model

令擬合方程的P=0.1、0.5、0.9，并用Excel 計算出不同P值(生長概率)條件下pH 預測值，其部分結果見表3。從表3 中可以看出，當溫度為30 ℃，水分活度為0.992，生長概率P=0.5 時，可以預測pH≤4.728 時蠟樣芽胞桿菌生長概率小于50 %;當P=0.1，即生長概率為10 %時，通過pH 預測值可以得出，只要使得pH≤4.61 時，就能控制微生物生長概率低于10 %。當溫度為30 ℃和25 ℃時，培養基的pH 值為7.5，水分活度≥0.96 時，蠟樣芽胞桿菌生長概率將會超過90 %。對于培養溫度為20 ℃，水分活度≥0.965 時要想控制蠟樣芽胞桿菌的生長概率低于50 %，則需要pH≤5.907。從所選的數據可以看出，綜合各生長概率來看，在水分活度較高的情況下，溫度對蠟樣芽胞桿菌的最低生長pH 的影響大于水分活度對最小pH 值的影響，而在水分活度較低的情況下，則情況相反。同樣類似的方法也可以求出預測溫度和預測水分活度。從表中還可以看出其中一個影響因子接近微生物生長的最小值時，預測值便出現異常，這些預測值雖然有著數學的意義，但在實際試驗中失去了微生物意義。雖然這個是該模型運用的缺陷，但是可以通過結合實際的微生物學意義以及人為的數據選擇與闡述來完善模型的使用。

圖1 描述了P=0.1、0.5、0.9 時不同溫度，水分活度和pH 作用下蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長界面。圖中以水分活度做為z 軸，紅色曲面代表P=0.9 時的界面，藍色曲面代表P=0.5 的界面，黃色曲面代表P=0.1 時的界面。黃色曲面以下的空間為蠟樣芽胞桿菌生長概率小于0.1 的情況;紅色曲面往上的空間為蠟樣芽胞桿菌生長概率大于0.9 的情況;中間空間為P∈［0.1，0.9］的轉換區域。令P值無限接近0 或者無限接近1，這樣可以得到更精確的微生物生長/非生長的轉換區域，而轉換區域之外的空間即為微生物生長和不生長2 種狀態，這對實際生產來說是最有意義。從圖中可以看出，3 種影響因子的協同作用對蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長影響較大。多種限制因子的協同作用會影響蠟樣芽胞桿菌的生長速率，但是當其中一種因子在最低生長條件以下時，其余因子對蠟樣芽胞桿菌的生長影響很?。?4］。

圖1 P=0.1、0.5、0.9 時蠟樣芽胞桿菌生長/非生長界面三維立體圖Figure 1 The three-dimensional representation (3D)of growth/no growth boundaries for Bacillus cereus while P=0.1、0.5、0.9.

表3 P=0.1、0.5 和0.9 時蠟樣芽胞桿菌生長/非生長(48h 后)預測pH 值的部分結果Table 3 Selected predicted values for the pH on the boundary of the growth/no growth interface(after48 h)for Bacillus cereus，corresponding to P=0.1、0.5 and 0.9 of growth

圖2 中的4 幅圖是AW分別為0.95、0.96、0.97和0.98 下的生長/非生長界面的橫截圖［26］。圖中“○”表示蠟樣芽胞桿菌生長概率為0;“△”表示蠟樣芽胞桿菌生長概率為0 ～1;“+”表示蠟樣芽胞桿菌生長概率為1。實線表示P為0.1 的生長/生長界線，虛線表示P為0.5 的生長/生長界線，點線表示P為0.9 的生長/生長界線。3 條線之間的區域為P∈［0.1，0.9］轉換區域。從這4 幅圖中可以明顯地看出這個轉換區域隨著水分活度的增加往溫度高的方向移動。

當水分活度為0.985 時，出現P=1 的情況較多;而當水分活度為0.950 時，蠟樣芽胞桿菌出現P=0的情況較多。因此水分越低，P∈［0.1，0.9］轉換區域越寬，過度越平緩。從圖2 中還可以看出培養基的pH 值越高，溫度越高蠟樣芽胞桿菌的生長概率越接近1，反之則越接近0。不同的環境條件對蠟樣芽胞桿菌生長概率的影響可以很直接地從橫截面中看出。

圖2 Aw分別為0.98、0.97、0.96 和0.95 時生長/非生長曲面的橫截圖Fig.2 The cross section of the growth/no growth interfaces while Aw was 0.98、0.97、0.96 and 0.95

3 討論

傳統意義上，研究學者通過建立微生物生長動力學模型來研究微生物生長速率和環境因素之間的關系。然而對于在低劑量便能導致感染的致病菌來說，研究如何抑制它的生長比研究其生長速率更為有意義。微生物的生長可以通過柵欄技術的應用而得到抑制［27］。柵欄技術通過科學合理的組合不同的柵欄因子，發揮其協同作用，從而抑制微生物生長。通過這種方法不僅使食品安全性得到了保證，同時也保持了大部分食品原有的感官和營養價值。這些抑制因子通常包括環境的溫度，pH 值，水分活度，防腐劑等。為了研究哪幾種柵欄因子組合的協同作用對抑制微生物的生長最有效，用于描述微生物生長/非生長界面的模型被建立。

目前建立的生長/非生長模型主要分為以下4 大類型:(1)確定性方法(2)最小凸多面體法(MCP)(3)logistic 回歸模型法(4)人工神經網絡法。前2 種方法認為生長與不生長之間有一個快速轉變的界面，后2 種方法則認為微生物生長與不生長之間是一個平緩過度的區域。有學者［27－28］對這些建模方法進行比較，由于范圍上受到了限制，比較結果也是前后矛盾。但是微生物生長與不生長之間存在平緩轉換區域的可能性已經被證實［29］。本文章中選用了logistic回歸模型。它是描述平緩生長/非生長轉換區域最常用的方法。它是Ratkowski［5］等人對微生物生長動力學平方根模型修正而來。該模型綜合了預測微生物學和柵欄技術、概率模型和動力學模型。模型需要在微生物的最小生長溫度、最小水分活度和最小pH 已知的情況下建立，因此本實驗對蠟樣芽胞桿菌在BHI肉湯培養基中的生長特性做了研究，通過實驗結果計算得出:蠟樣芽胞桿菌的最低生長溫度為9.99 ℃，最小水分活度為0.931，最小pH 為4.5。這也和Lake［19］等人的報道結果類似。但微生物的最低生長溫度，最低水分活度，最低pH 會因菌株的來源，培養基的類型，微生物所處的環境不一樣而有所不同。

模型是Ratkowski 和Ross 等人通過微生物生長動力學模型修正而得到，將動力學方程的左邊替換成logit(P)，P表示微生物生長的概率，P也作為一個應變量，其值是通過微生物生長/非生長數據計來獲得，當微生物生長則表示為“1”，不生長則表示為“0”。當給定微生物限制因子的條件，便可以通過代入生長/生長模型從而計算出此條件下微生物的生長概率。

該模型的χ2=49.73，P＜0.000 1，從擬合效果來看此模型很好地描述了溫度，水分活度和pH 值3 個環境因子對蠟樣芽胞桿菌的協同作用與其生長概率之間的關系。因此基于該模型，以軟烤蝦為原料，將蠟樣芽孢桿菌接種到實際產品中并進一步建立實際產品在不同柵欄因子條件下的生長/非生長模型來預測有害微生物在不同環境條件下的生長概率情況，以此確定出P∈(0，1)之間的區域，即生長/非生長轉換區域，根據該區域的兩端無限極限值來優化產品的柵欄因子條件和加工工藝以控制致病菌的生長。目前已有許多有關食品腐敗菌和致病菌的生長/非生長模型被建立并被運用到實際生產中去。這也將為建立軟烤蝦仁產品中蠟樣芽胞桿菌的生長/非生長模型提供更進一步的參考。

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