分散固相萃取-氣相色譜法測定茶葉中25種有機氯與擬除蟲菊酯農藥殘留

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(1中糧營養健康研究院，北京100020；2.北京市營養健康與食品安全重點實驗室，北京100020)

茶葉是我國傳統的農產品，其生產面積和總產量均居世界第一[1]。近年來，歐盟、日本等茶葉進口國家對茶葉制定了嚴苛的農藥殘留限量標準，農藥殘留檢測項目不斷增多，最大殘留限量大幅降低，茶葉的質量安全已成為我國茶葉出口的“綠色壁壘”[2]。2013年3月1日，《GB 2763-2012 食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》正式實施，新國標中涉及茶葉的最大農藥殘留限量品種增加到25種，因此建立茶葉中多種農藥同時分析的方法具有重要的現實意義。有機氯農藥是人工合成的含氯有機化合物，主要包括以苯為原料和以環戊二烯為原料合成的兩類化合物，有機氯農藥毒性強、不易分解，我國自1983年起已全面禁用六六六、滴滴涕等有機氯殺蟲劑[3]。擬除蟲菊酯農藥屬于仿生性殺蟲劑，其化學結構與天然除蟲菊素類似[3]。由于其具有高效低毒等特性，在我國茶園中得到廣泛應用，造成菊酯類農殘現象較為普遍。

文獻中已報道的提取與凈化方法有微波輔助萃取-固相微萃取[4]、直接懸掛液滴微萃取[5]、攪拌棒吸附萃取[6]、固相萃取[7-10]、QuEChERS[11]、加速溶劑萃取-凝膠滲透色譜[12]、亞臨界水萃取[13]，檢測方法有氣相色譜-電子捕獲檢測器(GC-ECD)[4-8,10,12]、液相色譜(HPLC)[9]、氣相色譜-質譜(GC/MS)[7,12,14]、氣相色譜-串聯質譜(GC/MS/MS)[13]和液相色譜-串聯質譜(LC/MS/MS)[11]。固相萃取提取效率高，但操作繁瑣、溶劑用量大且SPE柱成本較高；微波輔助萃取、加速溶劑萃取和凝膠滲透色譜等方法自動化程度高，但儀器投入較大、對操作人員也提出較高要求；質譜靈敏度高、可提供化合物的結構信息，在農殘分析研究中已廣泛應用，但質譜儀器昂貴、運行及維護成本較高，不適合基層企業日常檢驗使用。茶葉生產企業在對原料及產品的農藥殘留量監控過程中，需要對大量的樣品進行處理和檢測，因此，簡單快速的分散固相萃取前處理技術結合高靈敏度低成本的氣相色譜方法成為茶葉企業檢測有機氯與擬除蟲菊酯類農藥的首選方法。本研究通過乙腈超聲提取，石墨化炭黑(GCB)和乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)分散固相萃取凈化，結合GC-ECD檢測茶葉中25種有機氯與擬除蟲菊酯農藥的殘留量，建立了一個適合于企業質量控制的農殘檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GC-2010Plus氣相色譜儀(配ECD檢測器，日本島津公司)，TG 16-II臺式高速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)，BSA 224S-CW電子天平(德國賽多利斯集團)，SB-3200 DTDN超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)，HGC-24A氮吹儀(天津恒奧科技發展有限公司)，QL-902旋渦混合器(海門其林貝爾儀器制造有限公司)。

農藥標準品：α-六六六(α-BHC)、β-六六六(β-BHC)、γ-六六六(γ-BHC)、δ-六六六(δ-BHC)、七氯(Heptachlor)、艾氏劑(Aldrin)、o,p’-滴滴滴(o,p’-DDD)、o,p’-滴滴伊(o,p’-DDE)、o,p’-滴滴涕(o,p’-DDT)、p,p’-滴滴滴(p,p’-DDD)、p,p’-滴滴伊(p,p’-DDE)、p,p’-滴滴涕(p,p’-DDT)、α-硫丹(α-Endosulfan)、β-硫丹(β-Endosulfan)、硫丹硫酸酯(Endosulfan-sulfate)、聯苯菊酯(Bifenthrin)、甲氰菊酯(Fenpropathrin)、高效氯氟氰菊酯(Cyfluthrin)、氯菊酯(Permethrin)、λ-氯氰菊酯(Cyhalothrin)、氟氰戊菊酯(Flucythrinate)、高效氰戊菊酯(Esfenvalerate)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、三氯殺螨砜(Tetradifon)、噠螨靈(Pyridaben)(純度在87.0～99.6%，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司)。石墨化炭黑(GCB)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)(北京BESEP公司)。乙腈、正己烷、石油醚、丙酮、甲苯(色譜純，美國Fisher公司)。

茶葉樣品購自市場。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準儲備液的配制

精確稱取25種農藥的標準品，用甲苯-丙酮混合溶液配制成1 mg/mL的標準儲備液，于-18 ℃條件下儲存。

混合農藥標準儲備液：根據25種農藥在儀器上的響應值分別準確移取各種農藥標準品適量，用正己烷配制成混合標準儲備液，于-18 ℃冰箱中保存，使用時根據實際需要進行稀釋。

1.2.2 樣品前處理

粉碎：取茶葉樣品100 g，粉碎機粉碎，用圓孔篩篩出≤2.0 mm顆粒。混勻，裝入潔凈容器內，密封，冷藏保存。提取：將2.50 g(精確至0.01 g)干茶葉粉末，于50 mL離心管中加入10 mL乙腈，超聲提取20 min，于3000 r/min離心5 min。凈化：取一支10 mL離心管，加入30 mg GCB、40 mg PSA吸附劑，轉入上述上清提取液1.5 mL，渦旋混合3 min，于6000 r/min離心3 min，取出上清液0.8 mL，氮吹近干后以正己烷復溶至0.8 mL，過0.22 μm尼龍濾膜，待GC-ECD分析。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：DB-35ms毛細管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；恒線速率模式，初始流速1.0 mL/min；進樣口：分流進樣，分流比10∶1，溫度280 °C，進樣量1 μL；升溫程序：150 °C保持2 min，10 °C /min升至300 °C，保持30 min；載氣：N2，純度≥99.999%；ECD檢測器：溫度320 °C。

2 結果與討論

2.1 色譜柱的選擇

大部分有機氯和擬除蟲菊酯類農藥的極性較小，因此色譜柱優化實驗選用適合分析非極性與弱極性化合物的Rtx-1、DB-5MS和DB-35MS三種毛細管色譜柱，規格均為30 m×0.25 mm×0.25 μm。

結果表明，Rtx-1對聯苯菊酯和甲氰菊酯沒有達到有效分離；DB-5MS和DB-35MS對25種農藥均有較好的分離能力，由于DB-35MS具有更好的耐高溫性能，可在檢測時通過設置更高的柱箱溫度凈化色譜柱，降低基線升高對下一次分析造成的干擾，適用于多次連續進樣。因此本實驗選擇DB-35MS作為色譜柱。

2.2 提取劑的選擇

茶葉基質復雜且同時提取25種農藥，數量較多，極性也存在一定差異，因此實驗選擇了乙腈、石油醚、正己烷-丙酮(V∶V=9∶1)三種提取劑進行優化。

研究表明：如圖1所示，石油醚對5種農藥的加標回收情況不理想，β-六六六和δ-六六六的回收率小于30%；正己烷-丙酮和乙腈對大多數農藥有較好的回收率，可以滿足實驗要求，但丙酮對茶葉中的雜質提取較多，在色譜圖上雜質峰干擾嚴重、基線較差，無法滿足分析檢測需求；乙腈極性大、穿透性強，適合多農藥殘留的提取。因此，選擇乙腈作為提取劑。

圖1 3種提取劑對部分農藥回收率的影響

2.3 提取方式的選擇

實驗考察了搖床搖動、手動振蕩+渦旋和超聲3種提取方式。

3種提取方式中，搖床搖動需要1小時，提取時間較長，不適合企業的高通量分析；手動振蕩3 min+渦旋1 min時間短強度大，但是平行操作的誤差較大，回收率不穩定，實驗重現性差；超聲提取20 min條件下，大部分農藥具有較好的回收率，見圖2。因此選擇超聲20 min作為茶葉中有機氯和擬除蟲菊酯的提取方式。

2.4 吸附劑用量的選擇

實驗考察了GCB在5～30 mg和PSA在0～50 mg之間的用量。

GCB對茶葉中大量的色素有很強的去除能力，但同時也對農藥產生一定的吸附力，所以GCB的用量不宜太大；PSA有兩個氨基，能去除植物基質中的有機酸、金屬離子、多酚類物質和一部分色素。通過加標回收實驗發現，當GCB為30 mg、PSA為40 mg的用量時，除p,p’-DDT以外的大部分農藥均具有較高的回收率，見圖3與圖4。

圖2 超聲提取條件下25種農藥的回收率1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

圖3 不同GCB用量對25種農藥回收率的影響1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.5 工作曲線、線性范圍及檢出限的測定

配制25種農藥的混標工作液，以峰面積對濃度做工作曲線，結果見表1。在相應濃度范圍內，各農藥的響應值與濃度具有良好的線性關系。以S/N=3計算方法檢出限。25種有機氯和擬除蟲菊酯農藥的檢出限在0.0040 mg/kg～0.0108 mg/kg之間，25種農藥分離的色譜圖見圖5。

圖4 不同PSA用量對25種農藥回收率的影響1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

圖5 25種有機氯和擬除蟲菊酯農藥的GC-ECD色譜圖1.α-BHC、2.γ-BHC、3.β-BHC、4. 七氯、5.δ-BHC、6. 艾氏劑、7.o,p’-DDE、8.α-硫丹、9.p,p’-DDE、10.o,p’-DDD、11.o,p’-DDT、12.p,p’-DDD、13.β- 硫丹、14. p,p’-DDT、15. 聯苯菊酯、16. 硫丹硫酸酯、17. 甲氰菊酯、18.高效氯氟氰菊酯、19. 三氯殺螨砜、20. 氯菊酯、21. 噠螨靈、22. 氯氰菊酯、23. 氟氰戊菊酯、24. 高效氰戊菊酯、25. 溴氰菊酯

2.6 方法的回收率和精密度

在空白茶葉基質中分別加入適量的農藥標準品，使各農藥的加標濃度為10倍定量限(S/N=10)，實驗平行操作5次，計算方法的回收率和相對標準偏差，結果見表1。

表1 25種有機氯與擬除蟲菊酯農藥的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限、回收率和相對標準偏差

2.7 方法的應用

針對企業開發的前處理方法分析一個茶葉樣品，需要有機溶劑10 mL，處理時間約40 min，分散固相填料成本低于5元，適用于茶葉企業監測茶葉中的農藥殘留風險。應用本方法對2個綠茶樣品和2個花茶樣品進行上述25種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥的篩查檢測，結果見表2。實驗顯示4個茶葉樣品全部被檢出農藥殘留，但殘留量均低于GB 2763-2012中對茶葉農藥最大殘留限量的規定。

3 結論

采用超聲提取、分散固相萃取凈化-氣相色譜建立了茶葉中25種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥的分析方法。方法的檢出限(S/N=3)是0.0040～0.1084 mg/kg；在10倍定量限(S/N=10)的添加水平，大部分農藥的平均回收率在70.00～105.00%之間；相對標準偏差RSD(n=5)是5.07%～11.29%。同普通SPE方法相比，所建方法快速簡便、成本低廉，具有在企業推廣應用的實際意義。

表2 實際樣品檢測結果 (mg/kg)

(ND: 未檢出)

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