西藏紅景天提取物延長線蟲壽命和抗氧化活性探索

肖家軍，陸 媚，馬勝利，李 錦

淮南師范學院生命科學系，淮南 232001

紅景天為景天科紅景天屬，多年生草本或亞灌木植物，是珍稀藥食兩用植物之一，有“高原人參”之譽。該屬全世界有九十多種，我國約七十三種，居世界之首，主要分布在東北、西藏、新疆等地。我國在紅景天的應用方面有悠久的歷史:公元1200年的藏醫(yī)《四部醫(yī)典》已有記載，秦漢時期的《神農本草》、李時珍的《本草綱目》等都有記載，而且衛(wèi)生部1991年批準紅景天為新食品資源。近十多年的研究證明，紅景天具有提高機體免疫力、增強體質、抗氧化、抗疲勞、以及預防高原反應等多種功能［1］。

紅景天中含有多種化學成分，其中紅景天苷為迄今研究最多的已知有效成分之一，已經成為眾多臨床藥物的主要成分之一［2］。近年來研究也發(fā)現(xiàn)，紅景天苷具有抗輻射、抗缺氧等多種作用。為進一步發(fā)掘紅景天的有效成分，我們比較了紅景天粗提物及紅景天苷對延長秀麗隱桿線蟲壽命的差異，并從體外抗氧化活性的角度對其可能的機制作了初步分析。

1 材料與儀器

紅景天苷(重慶寰瑞生物技術有限公司，純度＞95%)、紅景天(青海雪域源土特產開發(fā)有限公司)、鄰苯三酚(溫州甌海精細化工有限公司)、30%過氧化氫(宿州化學試劑廠)、維生素C(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%)，其它試劑均為分析純。

E．coli OP50、野生型秀麗隱桿線蟲(N2)由本系王順昌教授惠贈。

RE3000A旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器公司);UV2300型紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司);LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠);DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海光都儀器設備有限公司);SW-CJ-1D型單人凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司);WD800CTL23-2H型格蘭仕微波爐(廣東佛山格蘭仕微波爐有限公司);FZ102型微型植物粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 實驗方法

2.1 紅景天成分的提取及濃度的配制

原料紅景天35度鼓風干燥，磨碎，過100目篩，稱取適量紅景天粉，水煮3次，合并水煮液，過濾，濃縮，得到母液為1 g/mL。用三蒸水配制不同濃度的紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液和VC溶液。

NGM(Nematodegrowth medium)標準培養(yǎng)基(1L)［3］121 ℃滅菌30 min，滅菌后加入1M CaCl2及1M MgSO4各l mL和25 mL 1M pH 6.0磷酸鉀緩沖液。E．coli OP50接種于含有不同藥物濃度的LB固體培養(yǎng)基中，37℃過夜后，置于4℃?zhèn)溆谩４菩弁w線蟲N2，接種于涂布E．coli OP50，且細菌生長良好的NGM上，恒溫20℃培養(yǎng)。

2.2 紅景天粗提物、紅景天苷等延長線蟲壽命實驗

秀麗隱桿線蟲壽命實驗設對照組和含藥組，對照組不含藥物，用藥組從低到高設3個濃度梯度。各組培養(yǎng)基中均含12.5 mg/L5-Fu以抑制線蟲子代的孵育，據(jù)文獻報道［4］，12.5 mg/L 5-Fu不影響線蟲壽命。挑取同步化的L4期線蟲到各組培養(yǎng)基中，每種藥物含30條，每個濃度板中含有10條，于20℃培養(yǎng)。從轉移時刻起開始計算線蟲存活天數(shù)，轉移當天記為壽命實驗第0天(day0)。隔天檢查線蟲，記錄死亡線蟲數(shù)，剔除逃逸、意外死亡和囊樣線蟲。線蟲死亡判斷標準:用鉑絲輕觸蟲體，無任何反應，即可判斷為死亡。

2.3 紅景天的體外抗氧化實驗

2.3.1 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液清除DPPH 自由基［5］

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進行濃度梯度稀釋，分別取出2 mL離心管中，并加入2 mL 0.25 mmol/L的 DPPH溶液，分別標記為 A1、A2、A3、A4、A5。暗處靜置 30 min，在 517 nm 處測光吸收值Ai。

再分別從濃度梯度母液取出2 mL于離心管中，并加入2 mL的50%乙醇，分別標記為A1’、A2’、A3’、A4’、A5’。暗處靜置 30 min，在 517nm 處測光吸收值Aj。

以2 mL 0.25 mmol/L的DPPH和2 mL 50%乙醇反應作參照，暗處靜置30 min，在517 nm處測吸收值 A0。

由公式:清除率 P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計算清除DPPH能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實驗過程相同。

2.3.2 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液清除羥基自由基［6］

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進行梯度稀釋，取有刻度的試管，分別標記為 B1、B2、B3、B4、B5。向5 mL離心管中加入0.5 mL的 Fe-SO4溶液，0.5 mL的H2O2溶液，1 mL的水楊酸溶液，1 mL的樣品液，1 mL的三蒸水，然后置于37℃的恒溫水浴鍋中反應30 min，取出在3000 r/min離心10 min，最后在510 nm波長處測吸光度值Ai。

用三蒸水代替水楊酸，方法和上面相同，在波長510nm處測吸光值為Aj。

空白對照組以三蒸水代替母液，其他和上面相同，在波長510nm處測吸光值為A0。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計算清除羥基自由基能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實驗過程相同。

2.3.3 紅景天粗提物溶液、紅景天苷溶液和Vc溶液清除超氧自由基［7］

向10 mL離心管中加入1 mL的三蒸水，4 mL的緩沖液，然后置于25℃的恒溫水浴鍋中反應200 min，加入0.1 mL的鄰苯三酚，混勻，再繼續(xù)水浴5 min，最后加入1 mL 8 mol/L的鹽酸，在420 nm波長處測其吸光度值。

取生藥量為1 g/mL的紅景天粗提物溶液進行梯度稀釋，取有刻度的試管，分別標上C1、C2、C3、C4、C5，向離心管中加入1 mL的樣品液，4 mL的緩沖液，然后置于25℃的恒溫水浴鍋中反應20 min，加入0.1 mL的三蒸水，混勻，再繼續(xù)水浴5 min，最后加入1 mL 8mol/L的鹽酸，在420 nm波長處測其吸光度值。由公式:清除率P%=［1-(Ai-Aj)/A0］×100%，計算清除超氧自由基能力。紅景天苷溶液和Vc溶液實驗過程相同。全部抗氧化實驗重復3次，計算平均值。

3 實驗結果與分析

3.1 紅景天粗提物等對秀麗隱桿線蟲壽命的影響

圖1 紅景天苷、紅景天粗提物等藥物對線蟲壽命的影響Fig.1 Effects of extending life span of C．elegans with the extract of Rhodiola tibetica and salidroside

從圖中可以看出，無論是與紅景天苷相比，還是與黃芪粗提物相比，紅景天粗提物在延長秀麗隱桿線蟲壽命方面都顯示了明顯的優(yōu)勢。在相同條件下，紅景天粗提物相比紅景天苷能夠顯著延長線蟲壽命，提示在紅景天粗提物中可能存在能明顯影響動物壽命的物質。

3.2 紅景天苷的體外抗氧化活性測定

圖2 紅景天苷、紅景天粗提物、Vc清除DPPH自由基Fig.2 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on DPPH free radical

3.2.1 各物質對DPPH自由基的清除作用

圖3 紅景天苷、紅景天粗提物、VC清除羥基自由基Fig.3 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on hydroxy radical

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除DPPH自由基的能力也逐漸增強。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得出紅景天苷溶液的EC50(即清除率達到50%時所需藥物的濃度為1291.53 μg/mL，而紅景天粗提取物溶液的EC50為489.76 μg/mL，VC的 EC50為 8.75 μg/mL。經計算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物溶液的2.6倍，約是VC的147.6倍。

3.2.2 各物質對羥基自由基的清除作用

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除羥基自由基的能力也逐漸增強。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得出紅景天苷溶液的EC50所需藥物的濃度為1120.94 μg/mL，而紅景天粗提取物溶液的EC50為1068.37 μg/mL，VC的EC50為579.27 μg/mL。經計算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物的1.1倍，約是VC的1.94倍。

4 紅景天苷、紅景天粗提物、VC清除超氧陰離子自由基Fig.4 Scavenging activities of the extracta of R．tibetica，salidroside and Vc on superoxide radical

3.2.3 各物質對超氧陰離子自由基的清除作用

由圖可以看出，樣品液隨著濃度的不斷增大，清除超氧陰離子自由基的能力也逐漸增強。借助DPS數(shù)據(jù)處理軟件對數(shù)據(jù)進行處理，得出紅景天苷溶液的EC50(即清除率達到50%時所需藥物)的濃度為55.57 μg/mL，而紅景天提取物溶液的EC50為40.49 μg/mL，VC的 EC50為 22.37 μg/mL。經計算得出紅景天苷溶液的EC50約是紅景天提取物溶液的1.4倍，約是VC的2.5倍。

4 討論

人類對于衰老的研究，已經達到分子水平，眾多的研究［8-10］表明，目前尚未發(fā)現(xiàn)目標單一的作用于衰老的基因，在研究的所謂衰老相關基因多是消除自由基的某些酶類基因，及與細胞生長調控有關的某些因子的基因。自由基對人體的危害是從對細胞和組織的損傷開始，Denham Harman博士 1956年［11］提出自由基衰老學說，其主要依據(jù)是在正常情況下機體的自由基的產生與消失處于動態(tài)平衡。一旦失去平衡即逐漸趨于老化，最終導致衰老，即生物體的衰老過程是機體的組織細胞不斷產生的自由基積累結果。

紅景天抗氧化活性受到很多學者的關注，國內學者大多以小鼠為研究對象，分析相關指標，探討紅景天的生物活性。從本實驗結果中可以看出，對秀麗隱桿線蟲壽命的影響中，紅景天的主要有效成分紅景天苷影響較小，而紅景天的粗提物表現(xiàn)較大優(yōu)勢。體外抗氧化結果表明，與VC相比，紅景天苷具有一定的清除DPPH、羥基自由基、超氧陰離子自由基能力，但抗氧化活性并不高，另一方面，紅景天苷與紅景天粗提物在清除這三種自由基的能力比較中，實驗數(shù)據(jù)表明，在相同實驗條件下，紅景天粗提物清除三種自由基的能力均強于紅景天苷，說明在紅景天中應該還存在某種或某類物質，其抗氧化活性比紅景天苷要強很多，具體成分還有待進一步研究。

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