米諾環素通過調控PI3K/Akt通路抑制硝普鈉誘導的PC12細胞凋亡*

吳秀勤， 楊煉紅△， 鐘健強， 葉晉豪， 劉淑瓊

(1中山大學孫逸仙紀念醫院神經科， 廣東 廣州 510120；2增城市人民醫院神經科，廣東 廣州 511300)

米諾環素通過調控PI3K/Akt通路抑制硝普鈉誘導的PC12細胞凋亡*

吳秀勤1， 楊煉紅1△， 鐘健強2， 葉晉豪1， 劉淑瓊1

(1中山大學孫逸仙紀念醫院神經科， 廣東 廣州 510120；2增城市人民醫院神經科，廣東 廣州 511300)

目的探討PI3K/Akt信號通路在米諾環素(minocycline,MC)抑制硝普鈉(sodium nitoprusside,SNP)誘導的PC12細胞凋亡中的作用。方法將體外培養的PC12細胞分為4組：空白對照組、SNP組、MC+SNP組和PI3K抑制劑LY294002+ MC+SNP組。用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞凋亡；Western blotting檢測不同時點(0.5、1、2、3 h)各處理組PI3K/Akt通路蛋白p-Akt和Akt的表達。結果SNP處理PC12細胞24 h能抑制細胞生長,加入10 μmol/L MC預處理30 min可明顯提高細胞活力，降低細胞凋亡率(P<0.05),抑制SNP誘導的PC12細胞凋亡。MC組的p-Akt表達高于其它組,而加入LY294002后可阻斷MC的上述效應。結論MC可通過調控PI3K/Akt通路抑制SNP誘導的PC12細胞凋亡。

PI3K/Akt信號通路； 米諾環素； 細胞凋亡； PC12細胞

米諾環素(minocycline,MC)是一種四環素類衍生物的抗生素，抗菌譜廣，脂溶性高，可以順利通過血腦屏障，在中樞神經系統可達到有效的臨床治療藥物濃度水平。近年來越來越多的研究表明，MC在腦外傷、腦缺氧、多發性硬化、肌萎縮側索硬化、帕金森氏病、亨廷頓病、癲癇等動物模型中均有明顯通過抗凋亡而起神經保護作用[1-3]。

關于MC抗凋亡的機制研究，磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號途徑是近年來的研究熱點。新近有研究發現MC通過保持PI3K/Akt信號途徑的活性[4]，抑制谷氨酸的釋放和谷氨酸受體，抑制谷氨酸誘導的細胞凋亡作用[5]。本實驗通過建立PC12細胞凋亡模型，觀察PI3K/Akt信號通路在MC抑制硝普鈉(sodium nitroprusside,SNP)誘導的PC12細胞凋亡中的作用。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

蛋白電泳裝置、RPMI-1640培養基(Gibco)、馬血清(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Akt Ⅰ抗(兔抗鼠)(Cell Signaling Technology)、Ser473磷酸化的Akt Ⅰ抗(兔抗鼠)(Cell Signaling Technology)和GAPDH Ⅰ抗。HRP標記的Ⅱ抗(羊抗兔，羊抗鼠)、BCA蛋白定量試劑盒(上海博彩公司)、LY294002(Cell Signaling Technology)和ECL化學發光試劑盒(Millipore)。

2方法

2.1PC12細胞培養及誘導分化 PC12細胞(由中山大學醫學院藥理教研室惠贈)置于含10%馬血清(Gibco)和5%胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培養基中，37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養。

傳代的PC12細胞中加入100 μg/L NGF，并培養在含膠原蛋白鋪板的細胞內，經7～8 d的誘導分化，長出突觸，用于實驗。

2.2PC12細胞凋亡模型建立及MTT法測定細胞活力 PC12細胞按密度為1×108cells/L、100 μL/well接種于96孔板，放置37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養至細胞長到60%～70%時，分別加入終濃度為300、400、500、600、700、800 μmol/L SNP溶液作用24 h，每孔加入5 g/L MTT(Sigma)溶液20 μL，37 ℃、5%CO2細胞培養箱放置4 h后棄去培養基，加入二甲基亞砜(Sigma)150 μL，振蕩10 min后，用酶標儀在570 nm波長處測定各孔的吸光度(A)。最后，按公式：細胞存活率(%)=處理組A值/對照組A值×100%，計算得出各組的細胞存活率。每個濃度設6個復孔，同時設與實驗孔平行的空白對照(不含細胞外，其它條件相同的對照孔)，最后比色時對照孔調零。根據上述的結果，再利用SPSS計算出IC50，以此濃度建立PC12細胞凋亡模型。

將PC12細胞按密度為1×108cells/L、100 μL/well接種于96孔板，放置37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養至細胞長到60%～70%時，分別加入0、0.01、0.1、1、10 μmol/L MC預處理30 min,每孔加入500 μmol/L SNP溶液作用24 h后，按前述MTT法測定細胞活力。

2.3Annexin V-FITC /PI染色法檢測細胞凋亡 將PC12細胞按密度為1×108cells/L、3 mL/well接種于6孔板中的1、2、3孔中，放置37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養至細胞長到50%～60%時，第3孔中加入3 μL 10 mmol/L MC，30 min后，于2、3孔中加入3 μL 500 mmol/L SNP后，將6孔板置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養24 h，再進行流式細胞術檢測(按Annexin V-FITC/PI試劑盒說明書操作)。

2.4Western blotting檢測Akt和p-Akt蛋白水平 細胞接種于60 mm培養皿中，各實驗組給予不同的處理因素后，分別于0.5 h、1 h、2 h、3 h用預冷的PBS液洗3次，加入按100∶1∶1配合的細胞裂解液(RIPA)和蛋白酶抑制劑(PMSF)以及磷酸酶抑制劑，4 ℃靜置30 min，用細胞刮刀刮下細胞，收集細胞懸液于1.5 mL Eppendorf管中，12 000 r/min離心30 min，取上清，采用BCA法進行蛋白定量。取70 μg蛋白提取液，95 ℃煮沸5 min，樣品于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠)分離后，轉移到PVDF膜上。用5%BSA封閉1 h，隨后分別加入抗Akt、p-Akt和GAPDH抗體，4 ℃過夜，用TBST洗3次，每次10 min。ECL法顯色。

3統計學處理

數據經SPSS 13.0軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1SNP誘導PC12細胞凋亡的最適合濃度

根據不同濃度(300、400、500、600、700、800 μmol/L)SNP作用24 h后PC12細胞的存活率，利用SPSS計算出SNP的IC50為500 μmol/L。

2MTT法測定MC對PC12細胞活性的影響

由圖1可知，500 μmol/L SNP溶液處理PC12細胞24 h后，43.12%的細胞生長被抑制，與不加任何處理的細胞比較差異顯著。而在用MC預處理30 min后，再用500 μmol/L SNP處理，則PC12細胞的存活率明顯提高，并隨著MC濃度的升高呈現明顯劑量依賴性，說明MC能明顯改善由SNP引起的細胞活性下降。

Figure 1. The effect of different concentrations of minocycline (MC) on the viability of PC12 cells induced by 500 μmol/L SNP.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group.

圖1不同濃度MC預處理對SNP誘導的PC12細胞活性的影響

3流式細胞術檢測凋亡

如圖2所示，實驗分為空白對照組、SNP組、MC+SNP組和MC+SNP+LY294002組。結果顯示，用SNP處理PC12細胞后，細胞的凋亡率較空白組升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而MC預處理30 min后，再用500 μmol/L SPN處理，PC12細胞的凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.05)。

Figure 2. Effect of 10 μmol/L MC pretreatment for 30 min on the apoptosis rate of SNP-induced PC12 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group;△△P<0.01vsSNP+MC group.

圖2MC對PC12細胞凋亡的影響

4蛋白免疫印跡法檢測Akt和p-Akt蛋白水平

SNP組與SNP+MC組比， Akt表達無明顯差異，而SNP+MC組的p-Akt表達增高，差異有統計學意義。用PI3K/Akt通路阻滯劑LY294002后，MC所起的保護作用被抑制，表現為p-Akt的表達量明顯減少，見圖3。

討 論

MC是第2代半合成的四環素類藥物，其分子量小，具有較高親脂性，容易透過血腦屏障到達中樞神經系統，動物模型研究表明,MC在腦中可以達50%的血藥峰濃度[6]，具有較高的生物學活性。目前，MC對中樞神經系統的作用已成為研究的熱點。越來越多的研究都致力于研究其對中樞神經系統的作用機制以望MC能更好地運用于臨床治療。本課題組在之前的實驗已證實MC可抑制海馬小膠質細胞活化、增生和炎癥因子腫廇壞死因子α的釋放[7]。而其它研究則表明MC可通過抗凋亡而起神經保護作用，但其機制目前尚無報道。

Figure 3. Effects of MC on the expression of Akt and p-Akt in PC12 cells.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSNP group;△△P<0.01vsSNP+MC group.

圖3MC對PC12細胞Akt和p-Akt表達的影響

關于MC抗凋亡的機制研究，PI3K/Akt信號途徑是近年來的研究熱點。MC能通過保持PI3K/Akt通路的活性而減少大鼠缺血誘導的室性心律失常的發生[8]。Wilkins等[9]發現MC通過PI3K/Akt途徑減少一氧化氮氧化介導的體外神經和軸突損傷。可見MC與PI3K/Akt通路有著密切的關系，由此我們猜想MC可能通過調節PI3K/Akt通路的活性而發揮其抗神經元凋亡、保護神經元的作用。因此，本實驗選用PC12細胞，用NGF誘導產生突觸后作為神經元模型，用SNP誘導PC12細胞凋亡，再用MC預處理，研究MC是否可通過調控PI3K/Akt信號通路的活性以抑制SNP誘導的PC12細胞凋亡。PC12細胞是大鼠腎上腺髓質瘤嗜鉻細胞瘤細胞系，富含酪氨酸羥化酶、單胺氧化酶和兒茶酚胺氧位甲基轉移酶，通過NGF誘導產生突觸，具有神經分泌的性質，因此被廣泛用于神經病學的研究[10]。

PI3K/Akt信號轉導途徑是細胞內重要的信號轉導通路，在細胞的凋亡、增殖、存活等活動中具有重要的生物學功能。PI3K是磷脂激酶家族中的一個重要成員，是由p110催化亞單位和p85調節亞單位組成的異源二聚體。蛋白生長因子和它的受體結合，誘導受體胞漿部分酪氨酸殘基自身磷酸化，募集并且激活PI3K。PI3K磷酸化磷脂酰肌醇4，4-二磷酸，使它轉化為磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸，通過PH結構域使Akt定位于細胞膜內表面，接著通過磷酸化2個重要的殘基Thr308(激酶結合域)和Ser473(疏水序基)使Akt激活。Akt是分子量約為60 kD的絲/蘇氨酸激酶。Akt能介導多種生物學效應，是重要的抗凋亡調節因子，是PI3K信號轉導途徑中一個重要的下游靶激酶[11]。因此，我們的實驗主要檢測Akt及p-Akt的蛋白表達，以觀察PI3K/Akt通路的活性。

本實驗發現，MC預處理30 min，可明顯改善細胞活性，并具有劑量依賴性。在給予10 μmol/L MC時，細胞存活率最大，為79.11%。同時，細胞凋亡從9.39%降到8.27%，說明MC具有顯著保護PC12細胞的作用。Western blotting結果顯示MC可使p-Akt表達增加，而加入PI3K/Akt通路阻滯劑LY294002后可阻滯該現象，說明MC可通過調控PI3K/Akt通路抑制神經元凋亡。

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[2] Wang X, Zhu S, Drozda M, et al. Minocycline inhibits caspase-independent and -dependent mitochondrial cell death pathways in models of Huntington’s disease[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003, 100(18):10483-10487.

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Minocyclinesuppressessodiumnitroprusside-inducedapoptosisinPC12cellsbyregulatingPI3K/Aktsignaling

WU Xiu-qin1, YANG Lian-hong1, ZHONG Jian-qiang2, YE Jin-hao1, LIU Shu-qiong1

(1DepartmentofNeurology,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;2DepartmentofNeurology,ZengchengPeople’sHospital,Guangzhou511300,China.E-mail:Docylh@yahoo.com.cn)

AIM: To explore the role of PI3K/Akt signaling in the anti-apoptotic effect of minocyline (MC) on the apoptosis of PC12 cells induced by sodium nitroprusside (SNP).METHODSPC12 cells were divided into 4 groups: blank control group, SNP (500 μmol/L) group, MC (10 μmol/L)+SNP group and LY294002+MC+SNP group. The cell viability was observed by MTT assay. The expression of Akt and p-Akt was determined by Western blotting.RESULTSThe viability of the PC12 cells decreased after exposed to 500 μmol/L SNP for 24 h. Meanwhile, MC at concentration of 10 μmol/L significantly blocked the effect of SNP, such as decreasing the cell viability. Pretreatment with LY294002 for 60 min prior to exposure of the PC12 cells to MC and SNP down-regulated the expression of p-Akt induced by SNP.CONCLUSIONMinocycline regulates PI3K/Akt signaling pathway to restrain the apoptosis of PC12 cells induced by SNP.

PI3K/Akt signaling pathway; Minocycline; Apoptosis; PC12 cells

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.04.015

1000- 4718(2013)04- 0660- 04

2012- 12- 07

2013- 03- 18

廣東省自然科學基金資助項目(No.S2011010004626)

△通訊作者 Tel: 020-81332621; E-mail: Docylh@yahoo.com.cn