小鏈霉菌HCCB10043敲除硫酯酶基因的工程菌株構建及其代謝產物的研究

尹 芳，饒 敏，魏 維，陳玲玲，陳代杰

(1．上海來益生物藥物研發中心生物Ⅱ實驗室，上海200240;2．上海交通大學藥學院，上海200240)

0 引言

近十年來，伴隨著基因組測序的高速發展，基因組測序揭示了許多鏈霉菌具有大量潛在的、與已知抗生素的生物合成基因類似的基因．例如，枯草芽孢桿菌的基因組密碼中，存在多于4%的基因可能是聚酮化合物和桿菌素的基因簇．模型菌Streptomyces coelicolor和工業菌株Streptomyces avermitilis的基因組序列分別揭示有20個和30個基因簇與次級代謝有關，主要為聚酮合酶(PKS)和非核糖體肽(NRPS)合成酶［1-2］，這些結果是出乎意料的，因為在此之前，從每一個菌株中只確定了少數生物活性化合物．所以，可能有許多有用的化合物在常規篩選條件下沒有被發現或在實驗室條件下沒有產生．未表達的基因簇被叫做沉默的或“隱藏的”基因，它們代表著數量可觀的潛在新藥．這些沉默的細菌素、PKS和NRPS基因簇引起微生物學家的極大興趣．

小鏈霉菌HCCB10043主要代謝產物為脂肽類物質A21978C，基因組序列揭示該菌體中存在多條類型為PKS、NRPS或PKS-NRPS混合的物質合成途徑，聯二吡啶類化合物的發現就是一個很好的證明．通過基因敲除和培養條件的改變，找到菌株代謝產物組中不同化合物生物合成途徑之間的關系，可以為闡明代謝物組、進而提高A21978C產量提供理論基礎，也為新藥研究提供化合物基礎．

有報道稱，Ⅱ型TE pikAV敲除后導致其目的產物的產量降低95%，而Butler［3］等在研究泰樂菌素(tylosin)生物合成基因簇TEⅡtylO敲除時發現突變株的22份發酵樣本中目的產物的產量很低但各不相同，范圍從野生菌株產量的15%到無不等，所以TEⅡ的缺失會嚴重影響相應目的產物的合成．

1 材料與方法

1．1 菌株與質粒

鏈霉菌:小鏈霉菌 HCCB10043(上海來益生物藥物研發中心保藏);大腸桿菌:E．coli DH5α、ET12567/pUZ8002(上海來益生物藥物研發中心保藏);質粒:pMD18-T Simper Vector(日本TAKARA公司);pKC1139(Amr)(上海來益生物藥物研發中心保藏)．

1．2 試 劑

與DNA相關操作試劑均由日本TAKARA公司提供;所有抗生素由上海生工進口分裝;EB溶液(10mg/mL)由上海生工生物提供;純化PCR產物試劑盒由上海萊楓生物有限公司提供．

1．3 培養基

(1)標準培養基:LB培養基、2×YT培養基、TSB合成培養基．

(2)MS固體培養基(g/L):甘露醇20、熟黃豆餅粉20、瓊脂粉20．

(3)發酵培養基(g/L):可溶性淀粉 20、NaNO32．0、CaCO32．0、K2HPO41．0、KCl 0．5、MgSO4·7H2O 0．5．

1．4 方 法

1．4．1 小鏈霉菌培養

(1)斜面孢子培養:MS斜面培養基上接種，置于28℃恒溫培養箱中培養4 d．

(2)搖瓶種子培養:將從斜面輕刮下面積0．5 cm2左右的孢子接種到含25 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，在28℃，240 r/min條件下培養42 h．

(3)搖瓶發酵培養:種子培養42 h后將2 mL種子液加入到含25 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，在28℃，240 r/min條件下培養4 d．

(4)液體試管培養:以無菌槍頭挑取少量孢子或吸取少量菌液于裝有3 mL TSB的小試管中(加2～3粒玻璃珠)，置于28℃搖床中，240 r/min振蕩培養2 d．

1．4．2 大腸桿菌的培養

大腸桿菌的活化及液體培養．

1．4．3 與DNA相關的操作

(1)菌株染色體DNA的提取方法參見文獻［4］．堿變法提質粒．

表1 特異型引物堿基序列

(3)PCR 反應體系:10×GC Buffer 12．5 μL;dNTP 2 μL;上游引物0．25 μL;下游引物0．25 μL;模板 DNA 0．5 μL;Prime STAR DNA polymerase(5 U/μL)0．25 μL;補水至總體積25 μL．

PCR反應條件:98℃ 1 min、72℃ 1 min共30循環;72℃ 4 min;4℃終止．

1．4．4 敲除質粒的構建

以溫敏型質粒pKC1139為載體，連接上下游兩條同源臂后構建成為可供基因改造的基因敲除質粒pKC1139-TE．

1．4．5 工程菌的構建

1．4．5．1 敲除質粒轉入菌株HCCB10043

采用接合轉移的方法，將已經成功構建的敲除質粒轉入小鏈霉菌HCCB10043中．具體步驟參見文獻［2］．

1．4．5．2 篩選突變菌株

旅游小鎮建設開發要適度，生態環境保護是第一要務，在保障生態環境的前提下漸進發展，如何平衡開發與保護，和諧發展，是武陵山鄉旅游小鎮建設的重要挑戰。

以安普霉素為抗性標記，對比篩選突變菌株．

1．4．6 發酵液處理

以等體積甲醇浸泡同體積發酵液，12 h后，將混合液于12000 r/min離心30 min，棄沉淀;浸提液作為待測試樣品．

1．4．7 樣品的UPLC-Q-TOF-MS分析

浸提液由上海交大分析測試中心進行UPLC-Q-TOF-MS分析測試．

流動相配制:A為0．1%甲酸水溶液，B為0．1%甲酸乙腈;色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18柱(2．1 ×100 mm，1．7 μm);柱溫:40℃;檢測器:DAD(HP1100)檢測器;檢測波長:210、245、280、390 nm;流速:0．4 mL/min;洗脫梯度見表2．

表2 流動相配制比例

MS參數:毛細管電壓3．0 kV，錐孔電壓35 V，源內溫度100℃，干燥氣流溫度250℃，干燥器流速400 L/h;碰撞能MS 6 eV、MS-MS35 eV，質量掃描范圍m/z800～2000，掃描時間1 s，掃描間隔時間0．02 s．

2 結果與分析

2．1 目的基因上下游同源臂基因序列的克隆

利用設計的引物，以HCCB10043基因組DNA為模板PCR擴增目的基因上下游序列(圖1左)，回收需末端加“A”，克隆到pMD18-T(3Kb左右)載體．提取克隆后的質粒，并對質粒進行雙酶切驗證(圖1右)并回收純化．

圖1 DNA片段電泳圖

2．2 敲除質粒的構建

限制性內切酶HindⅢ和EcoRI雙酶切質粒pKC1139，回收純化的線性質粒與目的基因的上下游同源臂同時連接(流程如圖2所示)，轉入E．coli DH5α擴增后，提取質粒并酶切驗證，雙酶切后質粒、同源臂長度分別為6．5 Kb和2 Kb，單酶切后敲除質粒長度為8．5 Kb(圖3)．經驗證正確后，得到敲除質粒pKC1139-TE．

圖2 敲除質粒構建流程

圖3 敲除質粒酶切后電泳圖

圖4 菌株驗證電泳圖

2．3 HCCB10043突變菌株基因型的驗證結果

以敲除目的基因的上下游同源臂連接后的片段為DNA模板，設計檢驗引物，PCR驗證同源臂之間目的基因長度，電泳檢驗條帶見圖4．陰性對照以原始菌株基因組DNA為模板，陽性對照以敲除質粒為模板，雙交換突變菌株條帶長度與陽性對照一致．

2．4 突變菌株發酵結果

菌株HCCB10043-Δ226在發酵培養基中發酵液UPLC-Q-TOF-MS結果見圖5，其中主要產物產量變化見表3．

菌株HCCB10043在M7發酵培養基中產生COL-C、COL-A、SF2738F這3個新的物質，通過對圖譜中3個物質的對比與分析，發現與原始菌株相比，敲除HCCB10043中基因簇226的硫酯酶結構域以后，COL-C、COL-A、SF2738F 的產量分別下降了 46．7%、52．8%、4．9%．

表3 發酵液中主要產物產量相對變化值(10043發酵產量為100%)

圖5 發酵液:HCCB10043(上)HCCB10043-Δ226(下)

3 討論

NRPS或I型PKS產物的釋放機制是由I型TE介導的．I型TE通常位于PKS或NRPS最后一個模塊的C-端，屬于α/β水解酶超級家族．TE I通過三聯體活性中心催化產物的釋放．與I型TE不同，有些TE游離于PKS生物合成基因簇的外部，被稱作Ⅱ型TE．目前對Ⅱ型TE功能的研究認為TEⅡ在PKS或NRPS合成過程中具有編輯或糾錯的功能，但是對于一些沒有TE I只有TEⅡ的PKS或NRPS來說，TEⅡ行使的是TE I的功能．關于TEⅡ的研究相對較少，近年來發現的苦霉素生物合成基因簇的pikAV，泰樂菌素生物合成簇的tylO都屬于Ⅱ型TE［5］．

工程菌HCCB10043-Δ226是一株敲除了一個TE結構域的突變株，該結構域位于聯二吡啶類抗生素生物合成基因簇的末端，為Ⅱ型TE，對合成產物起到糾錯的作用，但也可能只具有水解釋放化合物的作用．在最適宜的培養條件下，基因簇的合成產物因為末端TE基因的敲除使得相應代謝產物產量降低，本試驗結果顯示COL-C、COL-A、SF2738F 3種物質產量均下降，其中COL-A降幅最高達到52．8%，驗證了Ⅱ型TE在聯二吡啶類代謝產物合成途徑中的重要作用，但因為相應代謝物質只是產量上的差異，推測硫酯酶在合成途徑中的非必需作用．同時，根據物質守恒這一通用法則，菌體從外界環境吸收利用的物質的總量是有限的，那么物質流向成為不同代謝產物量或質的差別的關鍵．因此，通過相關代謝途徑中關鍵酶基因的敲除，人為地抑制或關閉菌體中非目標代謝產物的合成，使代謝流發生變化，使底物更多地用于目標化合物的合成．所以，本試驗結果為A21978C產量的提高提供了可能性探索．

［1］BENTLEY SD，CHATER K F，CERDENO-TARRAGA A M，et al．Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2)［J］．Nature，2002，417(6885):141-147．

［2］IKEDA H，ISHIKAWA J，HANAMOTO A，et al．Complete genome sequence and comparative analysis of the industrial microorganism Streptomyces avermitilis［J］．Nature，2003，21(5):526-531．

［3］BUTLER A R，BATE N，CUNDLIFFE E．Impact of thioesterase activity on tylosin biosynthesis in Streptomyces fradiae［J］．Chem Biol，1999，6(5):287-292．

［4］SAMBROOK J，RUSSELL D W．Molecular cloning:a laboratory manual［M］．3rd edn．Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory，2001．

［5］CLAXTON H B，AKEY D L，SILVER M K，et al．Structure and functional analysis of RifR，the type Ⅱ thioesterase from the rifamycin biosynthetic pathway［J］．JBiol Chem，2009，284(8):5021-5029．