重組質粒pcDNA3-β-NGF的構建及其轉染小鼠骨髓間充質干細胞生物學活性的研究*

畢 涌， 洪 娟， 李力群， 李曉莉， 魏 鵬， 施鎮江， 王廷華， 張 旭

(溫州醫科大學 1神經生物學重點學科， 2附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325000；3昆明醫學院神經科學研究所，云南 昆明 650031)

·短篇論著·

重組質粒pcDNA3-β-NGF的構建及其轉染小鼠骨髓間充質干細胞生物學活性的研究*

畢 涌1,2， 洪 娟1， 李力群1， 李曉莉1,2， 魏 鵬3， 施鎮江3， 王廷華3， 張 旭1,2

(溫州醫科大學1神經生物學重點學科，2附屬第一醫院神經內科，浙江 溫州 325000；3昆明醫學院神經科學研究所，云南 昆明 650031)

目的構建人神經生長因子β亞基(β-NGF)真核表達載體，轉染熒光小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)并研究其生物學活性。方法全骨髓貼壁培養法分離、培養和純化熒光小鼠MSCs，構建真核表達載體pcDNA3-β-NGF，并轉染MSCs；免疫組織化學染色檢測β-NGF的表達，觀察β-NGF陽性的MSCs對小鼠海馬神經元生長的作用。結果熒光小鼠MSCs可發出明亮的綠色熒光，且熒光不隨培養時間延長和傳代次數增加而衰減。重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染MSCs后β-NGF陽性率為(37.12±2.14)%，高于MSCs組[(2.36±0.62)%]和空白對照組[(1.43±0.76)%]，差異有統計學意義(P<0.05)。pcDNA3-β-NGF轉染MSCs上清液培養的新生小鼠海馬神經元的突起長度[(31±3)μm]較pcDNA3轉染MSCs組[(23±4)μm]明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，表明β-NGF基因轉染MSCs培養上清液中的產物能促進小鼠海馬神經元的突起生長，具有明顯的生物學活性。結論成功構建了pcDNA3-β-NGF真核表達載體，其轉染的熒光小鼠MSCs能正確、穩定表達和分泌有生物學活性的β-NGF。

神經生長因子； 間充質干細胞； 基因轉染

骨髓間充質干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)具有免疫原性弱、體外基因轉染率高、能穩定高效表達外源基因等優點，是作為細胞和基因治療種子細胞的理想選擇[5]。然而，干細胞移植后在體內的遷移、定植、分布和分化等有賴于對干細胞的示蹤和定量技術。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)轉基因小鼠MSCs能穩定表達GFP，是MSCs研究中良好的示蹤工具[6]。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，分子量較小，相對于完整的NGF分子則較易透過血腦屏障。因此，本研究將構建人β-NGF真核細胞表達載體并轉染GFP轉基因小鼠MSCs，觀察β-NGF的表達及其對小鼠海馬神經元的影響，為β-NGF的基因治療探索一種新的方法。

材 料 和 方 法

1主要試劑和儀器

DMEM/F12培養基和胰蛋白酶購自Gibco；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自HyClone。TRIzol RNA提取試劑盒、G418和β-NGF抗體購Sigma；IPTG、X-Gal、One Step RNA PCR Kit(AMV)、T4 DNA連接酶、限制性內切酶HindIII及XhoI、DNA凝膠純化試劑盒和DNA marker(DL2000和λ-EcoT14 I digest)購自TaKaRa；DH5α大腸桿菌由本實驗室保存；pcDNA3載體購自Invitrogen；脂質體LipofectamineTM2000購自Gibco；二步法免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術有限公司；PCR引物由上海博亞生物技術有限公司合成。超凈工作臺;25 cm2培養瓶(HyClone);SHEL LAB TC2323 CO2Incubator;Leica DM IRB熒光顯微鏡;Olympus倒置相差顯微鏡。

2方法

2.1GFP轉基因小鼠MSCs的分離培養和鑒定 GFP轉基因小鼠由昆明醫學院神經科學研究所提供。參照Phinney等[7]方法，脫頸法處死GFP轉基因小鼠，分離雙側脛股骨中全骨髓，采用全骨髓貼壁培養法獲取MSCs。按1×109/L接種于含10%胎牛血清的DMEM/F12混合培養液中，在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中培養。8 h后首次全量換液，此后每隔3 d全量換液。當細胞貼壁達90%融合時即可進行傳代。采用CD44、CD45和CD54抗體進行免疫組織化學染色，通過DAB顯色后光鏡下觀察并計算陽性細胞的百分比進行鑒定。

2.2真核表達載體pcDNA3-β-NGF的構建及鑒定

溫室栽培番茄育苗管理的關鍵時期，此時期如果管理不當，會對幼苗生產造成很大影響，稍有疏忽就會造成嚴重的經濟損失。那么應注意哪些問題呢？

2.2.1引物的設計與合成 根據GenBank公布的人β-NGFcDNA(No. X52599)序列設計PCR引物。上游引物為5’-CGAAGCTTAGCGTAATGTCCATGTTG-3’，下游引物為5’- GCCTCGAGGGCAGGTCAGGCTCTTCT-3’，下劃線為HindIII和XhoI的酶切位點。

2.2.2RNA的提取和RT-PCR反應擴增目的基因 取本實驗室保存的人腦瘤旁組織約50 mg，按TRIzol RNA提取試劑盒操作說明提取RNA，甲醛變性凝膠電泳檢測其完整性。取RNA 1 μg，濃度為20 μmol/L的上、下游引物各1 μL，參考TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AMV)試劑盒說明，按下列條件在PCR自動擴增儀上進行RT-PCR。50 ℃、30 min變性，94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共30個循環。瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR反應結果，用DNA凝膠純化試劑盒提取目的DNA的PCR產物。

2.2.3構建pcDNA3-β-NGF質粒并鑒定 RT-PCR反應產物目的DNA片段和pcDNA3分別進行HindIII和XhoI雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳檢測并線性化載體，用DNA凝膠純化試劑盒回收酶切DNA片段。酶切后的pcDNA3線性質粒和目的DNA片段以T4DNA連接酶建立連接反應，16 ℃連接20 h。取連接反應的產物轉化大腸桿菌DH5α，接種在含有X-Gal和IPTG并帶有氨芐青霉素的培養皿上，倒置培養12～16 h。根據藍白斑進行篩選，取陽性克隆(白斑)用SDS堿裂解法提取質粒。HindIII和XhoI雙酶切鑒定重組體及其插入方向，并送測序鑒定。

2.3重組pcDNA3-β-NGF轉染GFP轉基因小鼠MSCs 用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液將MSCs輕柔吹打成密度為1×109/L的細胞懸液，常規培養后用于轉染，轉染前全量換液1次。將MSCs以1×105/well的密度接種在24孔板中，分別加入不同濃度的G418培養基各1 mL置于37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下常規培養并觀察細胞生長情況，確定抑制細胞生長的最低G418濃度。

按脂質體LipofectamineTM2000的操作說明書，分別取純化的pcDNA3-β-NGF及空載體pcDNA3各4 μg，溶于100 μL DMEM/F12培養液中；加入LipofectamineTM2000和DMEM/F12培養液，室溫放置15 min后加入0.8 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液，于37℃、50%CO2培養箱中培養。轉染后72～96 h，待細胞生長至接近融合時，收集各組細胞的上清凍存備用，細胞傳代培養。繼續培養至細胞密度達培養皿底面積的60%～70%時，棄去培養液，更換含濃度為700 mg/L(參照最小致死濃度為600 mg/L的測定結果)的G418培養液進行篩選，對篩選形成的陽性克隆繼續擴增培養。陰性對照組以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液同法培養、篩選。

2.4重組pcDNA3-β-NGF轉染MSCs后β-NGF的表達 收集轉染后經G418篩選形成的陽性細胞克隆，以β-NGF抗體進行免疫組織化學染色檢測β-NGF的表達。先用4%多聚甲醛固定細胞20 min，再用0.01 mol/L PBS液洗去固定液，參考二步法免疫組織化學檢測試劑盒的使用說明進行操作，DAB顯色后光鏡下觀察。其中I抗稀釋度為1∶1 000，陰性對照組以0.01 mol/L PBS液代替I抗。

ELISA檢測β-NGF蛋白的表達：分別收集MSCs和各組轉染細胞培養48～72 h后的上清液，4 ℃保存，48 h內進行人β-NGF的ELISA檢測，每組設6個復孔；靈敏度為15 ng/L。

2.5重組pcDNA3-β-NGF轉染MSCs的生物學活性鑒定 將本實驗室保存的新生小鼠海馬神經元按每個培養培皿1×106個細胞接種在涂有多聚賴氨酸的35 mm培養皿中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液培養。48 h后將已收集備用的各組轉染細胞上清液與含10%胎牛血清的DMEM/F12培養液按1∶1的比例加入新生小鼠海馬元培養皿中，觀察細胞生長情況，測定神經突起長度并進行統計學分析。

3統計學處理

計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 17.0進行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1MSCs生長情況的形態學觀察和鑒定

骨髓細胞接種于培養瓶，4 h后可見到細胞貼壁生長，2 d后呈現勻一梭形成纖維細胞樣形態，呈集落生長，增殖迅速,見圖1A。原代細胞基本融合時進行傳代培養，傳至第5代時，MSCs形成形態均一、呈漩渦狀或放射狀排列生長的梭形細胞，見圖1B。CD44、CD54和CD45抗體對原代培養3 d及傳至5代的細胞進行免疫組織化學染色，第5代細胞的CD44(95.8%±0.8%)、CD54(91.4%±1.3%)陽性率較高，而CD45(2.1%±1.8%)陽性率較低，說明經全骨髓貼壁分離法傳代培養，MSCs的純度得到了提高，見圖1C、D。

Figure 1. Culture and identification of MSCs from GFP transgenic mouse.A: primary cells; B: fifth-passage cells after culture; C: CD44 immunopositivity; D: CD54 immunopositivity. Scale bar=100 μm.

圖1GFP轉基因小鼠MSCs的培養和鑒定

2RNA的提取和RT-PCR

RNA提取物經甲醛變性凝膠電泳檢測可見18S及28S 2個條帶，見圖2A；RT-PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示為大小為750 bp的特異性擴增條帶，見圖2B。將重組質粒pcDNA3-β-NGF進行限制性內切酶HindIII和XhoI雙酶切，可見酶切片段與插入基因長度750 bp相符，見圖2C。

Figure 2. Construction and identification of recombinant plasmid pcDNA3-β-NGF. A: formaldehyde-denaturing gel electrophoresis of total RNA from human brain tumor adjacent tissues. B: agarose gel electrophoresis of RT-PCR products. M: DL2000 DNA marker; 1～3: RT-PCR products (about 750 bp). C: agarose gel electrophoresis of digestion products. M: λ-EcoT14 I digest DNA marker; 1: pc-DNA3 digested byHindIII; 2: pcDNA3-β-NGF digested byHindIII andXhoI; 3: pcDNA3-β-NGF digested byHindIII.

圖2重組質粒pcDNA3-β-NGF的構建與雙酶切鑒定

3重組質粒pcDNA3-β-NGF測序鑒定

將重組質粒pcDNA3-β-NGF進行限制性內切酶HindIII和XhoI雙酶切，送上海申友公司測序，測序結果與GenBank公布的人β-NGFcDNA完全一致，見圖3、4。

Figure 3. Sequence analysis of pcDNA3-β-NGF beginning with the sequence of BGH poly(A).

圖3重組質粒pcDNA3-β-NGF以BGHpoly(A)序列為起點的測序圖

4重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染MSCs后β-NGF的表達

對轉染后經G418篩選的陽性克隆細胞進行二步法免疫組織化學檢測，DAB顯色后光鏡下觀察，G418篩選的重組質粒轉染陽性克隆細胞(37.12±2.14)%呈棕色的陽性反應，明顯高于MSCs組[(2.36±0.62)%]和空白對照組[(1.43±0.76)%]，差異有統計學意義(P<0.05),說明pcDNA3-β-NGF可以轉染MSCs，并使β-NGF表達顯著增加，見圖5A、B。

Figure 4. Sequence analysis of pcDNA3-β-NGF beginning with the sequence of T7 promoter.

圖4重組質粒pcDNA3-β-NGF以T7啟動子為起點的測序圖

轉染pcDNA3-β-NGF的3個單克隆MSCs擴增培養48 h后上清液中β-NGF的含量分別為(96±6.2)ng/L、(81±6.8)ng/L和(74±5.9)ng/L；轉染pcDNA3空質粒的2個單克隆MSCs和正常培養的MSCs培養48 h后上清液均未檢測到β-NGF蛋白。

5重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染MSCs后生物學活性的鑒定

重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染MSCs上清液培養的新生小鼠海馬神經元于3 d后在倒置相差顯微鏡下觀察見細胞存活良好，胞體長出明顯的突起；pcDNA3轉染MSCs組新生小鼠海馬神經元的胞體呈圓形，沒有明顯的突起。pcDNA3-β-NGF轉染MSCs組神經元的突起長度[(31±3) μm]較pcDNA3轉染MSCs組[(23±4) μm]明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05),表明陽性轉染細胞培養上清液中的產物能促進新生小鼠海馬神經元的突起生長，有明顯的生物學活性,見圖5C、D。

Figure 5. Biological characteristics of MSCs transfected with recombinant plasmid pcDNA3-β-NGF. A: immunopositive expression of β-NGF in the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF; B: negative expression of β-NGF in the MSCs transfected with pcDNA3; C: neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF; D: neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from the MSCs transfected with pcDNA3. Scale bar=100 μm.

圖5重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染MSCs后生物學活性的鑒定

討 論

NGF主要由α、β和γ 3個亞單位組成，對神經細胞的生長、發育、分化、再生及功能發揮起著重要的調節作用，與神經系統的發育、功能維持和損傷修復有密切關系[1]。然而，NGF不能有效通過血腦屏障，在腦內很快降解，需要持續給藥維持效果，且由于人體廣泛存在NGF受體，易出現明顯不良反應[3]。因此，選擇合適的給藥方式向靶部位連續不斷給藥顯得十分重要。通過基因轉染技術將細胞替代治療和NGF的神經營養能力聯合應用，使受損部位在一段時間內持續大量表達NGF可能是比較理想的給藥方式。

MSCs是一種具有自我復制、多向分化潛能的成體干細胞，具有免疫原性弱，體外基因轉染率高，能穩定高效表達外源基因等優點，已成為基因治療研究中理想的種子細胞。β亞單位是NGF完整的生物活性單位，不僅對神經細胞分化和生長具有有效的神經營養作用，還可誘導MSCs向神經元分化和生長[1-2,8]。因此，本研究通過重組質粒pcDNA3-β-NGF轉染成功實現了β-NGF在MSCs中的高效表達；轉染的MSCs擴增培養后上清液中β-NGF的含量明顯增多，細胞免疫組織化學染色結果表明，轉染組β-NGF陽性細胞明顯增多，染色更深，提示重組質粒β-NGF轉染MSCs可使β-NGF表達顯著增加。

NGF在腦部主要由皮質和海馬區產生，保護基底前腦膽堿能神經元以及紋狀體和海馬區神經元。汪軍兵等[9]研究顯示，NGF可抑制c-Jun氨基端激酶通路的活化，拮抗6-羥基多巴胺所誘導的大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞的凋亡。本研究中，pcDNA3-β-NGF轉染的MSCs上清液中β-NGF蛋白表達明顯增加；新生小鼠海馬神經元與pcDNA3-β-NGF轉染的MSCs上清液共培養后，胞體長出明顯的突起，其長度較pcDNA3轉染的MSCs明顯增加，說明β-NGF基因轉染后的MSCs具有理想的生物學活性。

此外，本研究采用全骨髓貼壁培養法，成功分離、培養了GFP轉基因小鼠的MSCs，在原代及傳代細胞中均持續表達GFP，發出明亮的綠色熒光，為干細胞移植后在體內的遷移、定植、分布、分化等研究提供了成熟、有效的示蹤技術。本研究還采用目前認為特異性相對較高的標記分子CD44和CD54抗體對原代培養3 d及傳至5代的細胞進行免疫組織化學染色進行鑒定，利用造血細胞的特異性標記CD45作為對照。結果顯示，傳代培養第5代細胞的CD44和CD54陽性率較高，而CD45陽性率較低，說明經貼壁分離傳代培養后，MSCs的純度得到了明顯提高，與Colter等[10]研究一致 。

綜上所述，本研究成功構建了人β-NGF真核細胞表達載體并轉染GFP轉基因小鼠MSCs，應用ELISA和免疫組織化學染色檢測等方法證實了構建的成功，并在體外培養條件下，驗證了β-NGF的生物學活性，為進一步的在體移植研究奠定了一定的基礎。

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BiologicalcharacteristicsofbonemarrowmesenchymalstemcellsfromGFPtransgenicmicetransfectedwithhumanβ-nervegrowthfactorgene

BI Yong1,2, HONG Juan1, LI Li-qun1, LI Xiao-li1,2, WEI Peng3, SHI Zhen-jiang3, WANG Ting-hua3, ZHANG Xu1,2

(1DepartmentofNeurobiology,2DepartmentofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China;3InstituteofNeuroscience,KunmingMedicalCollege,Kunming650031,China.E-mail:drzhangxu@live.cn)

AIM: To investigate the changes of biological characteristics of GFP transgenic mouse bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs), which were transfected with human β-nerve growth factor (β-NGF) gene in a recombinant eukaryotic expression vector.METHODSMSCs obtained from GFP transgenic mice were isolated, cultured and purified by the whole bone marrow adherence methods. Humanβ-NGFgene was transfected into the MSCs by a recombinant eukaryotic expression vector. The β-NGF expression in the MSCs was detected by the method of immunocytochemistry. Hippocampal neurons from neonatal mice were cultured with culture supernatant of the MSCs transfected with pcDNA3-β-NGF and the biological characteristics of the MSCs were investigated 3 d after culture under inverted phase-contrast microscope.RESULTSThe β-NGF positive rate of MSCs in pcDNA3-β-NGF transfection group [(37.12±2.14)%] was significantly higher than that in MSCs control group [(2.36±0.62)%] and blank control group [(1.43±0.76)%].The neurite length of neonatal mouse hippocampal neurons cultured with culture supernatant from pcDNA3-β-NGF-transfected MSCs [(31±3)μm] was significantly longer than that in negative control group [(23±4)μm], suggesting that MSCs transfected withβ-NGFgene maintained better biological characteristics.CONCLUSIONThe constructed recombinant eukaryotic expression vector of humanβ-NGFgene can be transfected into MSCs efficiently and NGF can be effectively expressed in MSCs. MSCs transfected withβ-NGFgene are capable of stable expression and secretion of β-NGF, and maintenance of better biological characteristics.

Nerve growth factor; Mesenchymal stem cells; Gene transfection

R741.05; R329.28

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.030

1000- 4718(2013)11- 2082- 06

2013- 04- 08

2013- 10- 16

浙江省高?！笆濉鄙窠浬飳W重點學科資助項目(No.204-071006)；浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2101091)；溫州市科技計劃項目(No.Y2013S0212；No.Y2013S0239)

△通訊作者 Tel: 0577-55579371; E-mail: drzhangxu@live.cn