黑木耳提取物對膿毒血癥大鼠肝功能的保護作用*

孫 湛， 馬小娟， 姚雪萍， 于文燕， 馬 琪△

(新疆醫科大學基礎醫學院 1機能中心實驗室， 2病理生理學教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

黑木耳提取物對膿毒血癥大鼠肝功能的保護作用*

孫 湛1， 馬小娟2， 姚雪萍1， 于文燕2， 馬 琪1△

(新疆醫科大學基礎醫學院1機能中心實驗室，2病理生理學教研室，新疆 烏魯木齊 830054)

目的探討黑木耳提取物對膿毒血癥大鼠肝功能的保護作用及其機制。方法40只健康雄性Wistar大鼠，隨機抽取10只為假手術組，其余大鼠使用盲腸結扎穿孔(CLP)法制備膿毒血癥動物模型，分為CLP組、黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組，術前3 d分別給予預防性灌胃，造模12 h后，下腔靜脈采血檢測肝功能指標(ALT和AST)、內毒素(ET)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)和IL-6，取肝標本做病理分析，免疫組織化學法觀察肝組織NF-κB的表達。結果應用黑木耳粗提物及黑木耳多糖干預后，大鼠血清中ALT、AST、ET、TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著低于CLP組(P<0.05)；肝組織病理改變減輕。CLP組肝細胞NF-κB強陽性表達，與對照組相比差異顯著(P<0.05)；黑木耳粗提物組和黑木耳多糖組肝細胞NF-κB弱陽性表達。結論黑木耳粗提物及黑木耳多糖在有效降低膿毒血癥大鼠血清ET的基礎上，同時降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量，抑制膿毒血癥大鼠肝組織細胞NF-κB的表達，對膿毒血癥大鼠肝臟功能有保護作用。

黑木耳提取物； 膿毒血癥； 肝功能； 全身炎癥反應綜合征

膿毒血癥(sepsis)是嚴重創傷、燒傷、休克、大手術后常見的并發癥，進一步發展可導致膿毒性休克和多臟器功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的發生，嚴重威脅患者生命。肝功能衰竭在各器官衰竭中發病率很高，肝細胞功能障礙又能誘發其它器官功能衰竭。因此，如何減輕膿毒血癥造成的肝功能損傷成為治療膿毒血癥的重要部分。隨著對膿毒血癥發病機制和病理進程了解的不斷深入，現認為膿毒血癥的發病機制和造成的組織損傷是一系列細胞因子和炎癥介質相互作用并作用于組織的結果[1]。

黑木耳是人們日常生活中的天然物質，且在我國資源豐富，是一種藥食兩用大型真菌。目前已發現黑木耳多糖(A.auricula-judaepolysaccharide)具有多種生物活性作用[2-4]，我們已經通過實驗證實，黑木耳粗提物(A.auricula-judaecrude extract)能明顯降低大鼠感染性休克過程血清中的內毒素含量，并對于感染性休克造成的心功能損害有保護作用，能有效保護心臟功能[5]。本研究擬通過盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)復制膿毒血癥的急性肝損傷大鼠模型，探討黑木耳粗提物和黑木耳多糖在膿毒血癥大鼠模型中保護肝臟功能的作用，并探討其機制。

材 料 和 方 法

1材料

1.1動物 清潔級成年Wistar雄性大鼠40只，體重200～220 g，購于新疆醫科大學實驗動物中心。

1.2主要試劑及藥品 內毒素檢測試劑盒購自上海潤成生物科技有限公司；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)和IL-6 ELISA試劑盒、NF-κB p65免疫組化抗體購自北京永輝生物科技有限公司；顯色基質鱟試劑盒上海榕柏生物技術有限公司；東北黑木耳購自青島金海鷗水產有限公司，生產許可證號為QS370222010100。

2主要方法

2.1黑木耳粗提物和多糖的提取與純化 采用黑木耳干子實體熱水浸提法制備黑木耳提取物。稱取一定量烤干至恒重的黑木耳樣品，粉粹后加40倍水，90 ℃浸提3.5 h，重復抽提3次，蒸發濃縮，獲得黑木耳粗提物。繼續在上清液加入4倍體積的分析純乙醇沉淀，沉淀即為黑木耳粗多糖。黑木耳粗多糖經Sevage 法反復脫蛋白、離心，減壓濃縮、真空冷凍干燥后得到黑木耳多糖粉末，備用。

2.2膿毒血癥大鼠模型制備及分組 雄性Wistar大鼠40只，稱重后隨機法分為假手術組、CLP組、CLP+黑木耳多糖組和CLP+黑木耳粗提物組，每組10只。術前灌胃3 d，假手術組和CLP組使用生理鹽水灌胃，黑木耳多糖組和黑木耳粗提物組分別給予1%黑木耳多糖和1%黑木耳粗提物灌胃，每隔8 h灌胃1次，劑量為15 mL/kg體重。應用CLP法制備膿毒血癥動物模型，手術區域5%碘酊消毒，75%乙醇脫碘2次，對照組大鼠開腹分離腸系膜翻動盲腸，不結扎穿刺，關腹；其余各組開腹分離腸系膜，找出盲腸結扎穿刺。

2.3標本采集 術后12 h，以20%烏拉坦1.5 g/kg的劑量腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，分離血清，-20 ℃保存。取肝臟，用濾紙吸干表面血液后，取部分組織固定于甲醛中用于石蠟切片。

2.4檢測指標 用顯色鱟試劑定量測定法測定血清內毒素含量。血清TNF-α、IL-1β、IL-6、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)水平分別采用相應的試劑盒嚴格按照試劑盒操作說明書進行測定。將石蠟包埋的肝組織制成4 μm厚的連續切片，用DAB法檢測NF-κB的蛋白表達情況。以PBS代替Ⅰ抗進行免疫組織化學反應作為陰性對照。每張切片隨機選取8個高倍視野，每組選取8張切片，經Olympus圖像采集系統采集圖像，利用Image-Pro Plus 5.1分析軟件分析，每張切片于400倍鏡下隨機選取5個不同視野彩圖，應用Meta Morph軟件測定陽性細胞的積分吸光度(IA)。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，應用SPSS 17.0統計軟件檢查方差齊性，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1肝功能相關指標的變化

CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清ALT及AST水平均高于假手術組，差異有統計學意義(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預后，大鼠血清中ALT及AST水平明顯低于CLP組(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. Effects of different treatments on the serum levels of ALT and AST in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖1不同處理對膿毒血癥大鼠血清ALT及AST水平的影響

2各組大鼠肝組織病理變化

CLP組大鼠肝臟鏡下可見肝細胞胞膜下有大量炎癥細胞浸潤，肝細胞呈片狀水腫，大小不均勻，匯管區血管擴張充血，肝索排列已不清晰，胞核大小不規則；黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠肝臟光鏡下觀察少量散在的炎癥細胞浸潤，肝細胞輕度腫脹，肝組織結構基本完整，見圖2。

Figure 2. The pathological changes of liver tissues in different groups(HE staining, ×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

圖2各組肝臟組織病理學改變

3各組大鼠血清內毒素的變化

與假手術組比較，CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清內毒素水平均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預后，大鼠血清內毒素較CLP組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

Figure 3. Effects of different treatments on the level of endotoxin(ET) in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖3不同處理對膿毒血癥大鼠血清內毒素水平的影響

4各組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的變化

CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6較假手術組均明顯增高，差異有統計學意義(P<0.05)，黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預后，大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平明顯低于CLP組， IL-6水平低于CLP組，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

Figure 4. Effects of different treatments on the level of TNF-α, IL-1β and IL-6 in sepsis rats. Mean±SD.n=10.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCLP group.

圖4不同處理對膿毒血癥大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平的影響

5肝組織NF-κB的表達

假手術組肝細胞中NF-κB較弱地表達；CLP組肝細胞NF-κB強陽性表達，與假手術組分別相比差異顯著(P<0.01)；黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組肝細胞NF-κB呈弱陽性表達，見圖5、表1。

Figure 5. The expression of NF-κB in liver tissues (SP,×400). A: control group; B: CLP group; C:A.auricula-judaecrude extract group; D:A.auricula-judaepolysaccharide group.

圖5各組NF-κB在肝臟的表達情況

表1各組肝組織NF-κB的免疫組化圖像分析結果

Table 1. The result of NF-κB expression in liver tissues detected by immunohistochemistry (Mean±SD.n=10)

GroupNF-κBexpressionControl16395.57±463.96CLP75508.08±756.36**A.auricula-judaepolysaccharide22724.59±984.97##A.auricula-judaecrudeextract21869.63±953.28##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsCLP group.

討 論

膿毒血癥是嚴重創傷、燒傷及大手術后常見的并發癥，臨床上常常伴有MODS，是ICU患者主要死亡原因之一。膿毒血癥急性肝損傷可發生在膿毒血癥的任何階段，膿毒血癥發展為多臟器功能衰竭的標志之一是肝功能不全。膿毒癥發病機制復雜，主要病理生理基礎是以細胞因子為代表的多種炎癥介質的失控性釋放，某些介質對膿毒血癥的產生和發展起十分重要的作用。本實驗檢測CLP組大鼠血清中內毒素水平高于假手術組，黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組內毒素水平明顯低于CLP組。CLP組反映肝功能的指標(AST和ALT)較假手術組也明顯增高，黑木耳粗提物組及黑木耳多糖組AST和ALT水平均低于CLP組，差異有統計學意義。CLP組肝組織切片中顯示有大量炎性細胞浸潤，肝細胞呈片狀水腫，大小不均勻。以上肝細胞的形態學改變也都提示肝細胞有嚴重的損害，表明CLP組大鼠肝臟嚴重損害；而黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預組，肝臟損傷較CLP組輕。

在炎癥反應發生發展中，內毒素可直接刺激細胞分泌TNF-α，TNF-α起著始動作用，炎癥反應過程中TNF-α是始動因素，IL-1β則起到協同作用。IL-1β主要存在于血液循環中，是具有多向性生物功能的炎癥介質，能誘發機體代謝和血流動力學明顯變化，促進炎癥介質生成，導致炎性因子“瀑布效應”， IL-6具有強烈的中性粒細胞趨化作用和激活作用。NF-κB是多種促炎癥基因高度轉錄的必需因子，可以促進與TNF-α等炎癥因子有關的多種基因的轉錄，從而參與不同原因引起的組織損傷過程[6-7]。本研究中，CLP組、黑木耳多糖組及黑木耳粗提物組大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6較假手術組均明顯增高，差異有統計學意義，給予黑木耳多糖及黑木耳粗提物干預后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯低于CLP組。假手術組肝細胞中NF-κB較弱地表達，CLP組肝細胞NF-κB強陽性表達，而干預各組肝細胞NF-κB較CLP組表達弱。

黑木耳是人們日常生活中的常見真菌類植物，有藥食兩大功能，在《神農本草》和《本草綱目》中均有介紹，現代研究發現，黑木耳中的黑木耳多糖具有免疫調節、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、抗氧化等多種生物活性。我們已發現黑木耳多糖在感染性休克、膿毒血癥時具有抗炎作用，并且能保護心功能。在本實驗中，應用黑木耳提取物給膿毒血癥大鼠進行預防性灌胃，對大鼠的肝臟起到保護作用，其作用機制可能與抑制全身炎癥反應有關。另外，通過不同的提取方式獲得黑木耳多糖及黑木耳粗提物，這兩種提取物對膿毒血癥大鼠的保護作用沒有顯著差異，對于黑木耳提取物的有效成分還有待于進一步研究。

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ProtectiveeffectofA.auricula-judaeextractsonliverfunctioninsepticrats

SUN Zhan1, MA Xiao-juan2, YAO Xue-ping1, YU Wen-yan2, MA Qi1

(1LaboratoryofFunctionalScience;2DepartmentofPathophysiology,BasicMedicalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054,China.E-mail:maqi1111@126.com)

AIM: To explore the effects ofAuricularia(A.)auricula-judaeextracts on the liver function in septic rats.METHODSForty male Wistar rats were randomly divided into control group, model group,A.auricula-judaepolysaccharide group andA.auricula-judaecrude extract group. Septic model was induced by the procedure of cecal ligation and puncture (CLP). Intragastric administration was performed every 8 h 3 days prior to CLP. The plasma levels of alanine aminotransferase(ALT), aspartate aminotransferase(AST), endotoxin(ET), tumor necrosis factor α(TNF-α), interleukin 6(IL-6) and IL-1β were detected 12 h after CLP. The specimens of the liver were collected to observe the pathological changes. The expression of NF-κB in the liver tissues was detected by the method of immunohistochemistry.RESULTSCompared with the CLP rats, the intervention ofA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract to the septic rats significantly decreased the serum levels of ALT, AST, ET, TNF-α, IL-1β and IL-6 (P<0.05). The pathological changes of the liver tissues in treatment groups were significantly attenuated compared with CLP group.CONCLUSIONA.auricula-judaepolysaccharide andA.auricula-judaecrude extract protect liver against sepsis-induced injury by inhibiting the systemic inflammatory response.

Auriculariaauricula-judaeextract; Sepsis; Liver function; Systemic inflammatory response syndrome

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.028

1000- 4718(2013)11- 2072- 04

2013- 04- 17

2013- 09- 24

國家自然科學基金資助項目(No. 81260454)

△通訊作者 Tel: 0991-4365064; E-mail: maqi1111@126.com