口服鹽酸法舒地爾治療小鼠EAE有效性初探*

張 輝， 張海飛， 李艷花， 劉春云， 尉杰忠， 丁智斌， 楊興旺，， 楊琬芳， 李俊蓮， 馮前進， 豐 玲， 肖保國，4， 馬存根， △

(1山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科，山西 太原 030001； 2山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民醫院神經科，山西 大同 037009； 4復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025；5山西中醫學院第三中醫院腦病科，衛生部國家臨床重點專科，山西 太原 030024)

口服鹽酸法舒地爾治療小鼠EAE有效性初探*

張 輝1,2， 張海飛2，3， 李艷花2， 劉春云2， 尉杰忠2， 丁智斌1,2， 楊興旺2，5， 楊琬芳5， 李俊蓮5， 馮前進5， 豐 玲2， 肖保國2，4， 馬存根1,2，5 △

(1山西醫科大學第一臨床醫學院神經內科，山西 太原 030001；2山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009；3大同市第五人民醫院神經科，山西 大同 037009；4復旦大學華山醫院神經病學研究所，上海 200025；5山西中醫學院第三中醫院腦病科，衛生部國家臨床重點專科，山西 太原 030024)

目的探討鹽酸法舒地爾口服對實驗性自身免疫性脊髓炎(EAE)的治療效果及機制。方法采用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白33-35肽(MOG35-55)免疫雌性C57BL/6小鼠建立慢性EAE模型，隨機分為EAE模型組和法舒地爾治療組。免疫后第3天，對照組予以灌胃生理鹽水，治療組予以法舒地爾，每天1次至免疫后第27天。比較2組小鼠體重變化和臨床評分。第28天處死動物，脊髓冰凍切片進行髓鞘染色和HE染色，流式細胞術檢測脾細胞M1型和M2型巨噬細胞的表型， ELISA法檢測脾細胞培養上清液白細胞介素 10(IL-10)、白細胞介素 1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)的釋放。結果法舒地爾口服推遲EAE發病時間，減緩EAE癥狀，減少體重下降，減少EAE髓鞘脫失和中樞神經系統炎癥浸潤，抑制M1型巨噬細胞CD16/32表達，增加M2型巨噬細胞CD206和IL-10表達，同時抑制炎癥細胞因子IL-1β和TNF-α的釋放。結論法舒地爾口服具有良好的治療效果，可明顯減輕中樞神經系統的髓鞘脫失和炎癥病灶。其作用機制可能使M1型巨噬細胞向M2型轉化，從而抑制炎癥細胞因子釋放。

法舒地爾； 口服； 實驗性自身免疫性脊髓炎； 巨噬細胞； 細胞因子類

多發性硬化(multiple sclerosis, MS)是中樞神經系統炎癥脫髓鞘性自身免疫性疾病，其病理特征是T細胞介導的自身免疫而引起髓鞘脫失和軸突損害，具有高致殘率和高復發率等特點。MS的治療主要采用皮下或肌內注射類固醇藥物和干擾素β(interferon β, IFN-β)等方法，但給藥途徑繁瑣、副作用大、患者依從性差和費用昂貴等缺點。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)與MS在臨床和病理機制等方面有很多相同和相似之處[1]，是研究MS的理想動物模型。Rho/Rho相關激酶(Rho-associa-ted kinase, ROCK)信號通路是機體內普遍存在的一種信號通路，主要參與血管收縮、炎癥反應、細胞凋亡等生命活動。近年的研究發現在神經系統退行性疾病如MS和帕金森病(Parkinson disease, PD)等病理過程中，ROCK的異常激活發揮著重要作用。鹽酸法舒地爾(fasudil)是臨床和科研上常用的ROCK抑制劑，我們前期的研究證實腹腔注射具有良好的治療EAE的作用[2]。但是MS作為一個復發緩解的慢性疾病，長期采用靜脈給藥顯然存在很大的局限性。因此，本研究目的是探討法舒地爾口服途徑治療EAE的有效性，并探討其作用機制，為今后臨床使用法舒地爾口服治療MS等神經炎癥或變形疾病提供實驗依據。

材 料 和 方 法

1動物和材料

雌性C57BL/6小鼠14只，8～10周齡，體重18～20 g，購自北京維通利華公司。小鼠髓鞘少突膠質細胞糖蛋白35-55肽(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide, MOG35-55)由西安聯美生物科技有限公司合成；完全福氏佐劑購自Sigma；結核分枝桿菌(tuberculosis bacilli,TB)H37Ra購自BD；百日咳毒素(pertussis toxin, PTX)購自ENZO；白細胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)、IL-10和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)測定ELISA試劑盒購自Peprotech。流式細胞儀為BD FACS Calibur產品。流式抗體購自Becton Dickinson。

2主要方法

2.1EAE模型制備及法舒地爾處理

2.1.1EAE模型制備 C57BL/6雌性小鼠實驗前在無病源菌實驗室飼養1周后，按平均體重隨機分為EAE對照組(n=7)和法舒地爾治療組(n=7)。將3.5 mg MOG35-55溶解于0.7 mL生理鹽水，4.2 mg TB溶解于0.7 mL完全福氏佐劑，兩者混合，用針管混合器推成油包水樣乳劑，乳劑靜置后無擴散即為合格。小鼠用乙醚麻醉后，于小鼠脊柱兩側分4點皮下注射，每只0.1 mL。于免疫當天和48 h后，腹腔分別注射PTX(每只0.75 mg)以加強動物免疫反應。

2.1.2法舒地爾處理 鼠免疫后第3天開始灌胃(生理鹽水每天每只200 μL， 法舒地爾每天每只1 mg/200 μL)，持續給藥至免疫后27 d。自免疫當天開始每天觀察小鼠臨床評分并記錄其體重變化。臨床評分標準采取國際通用的5分法：0分，無任何臨床癥狀；1分,尾部張力消失，可見輕度步態笨拙；2分，一側后下肢無力，被動翻身可以恢復；3分，雙后肢癱瘓，被動翻身不能恢復，但予以刺激可以挪動；4分，雙后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分，瀕死狀態或死亡。評分介于兩者之間者以±0.5分計。累積臨床評分[3]為自小鼠發病當天起(疾病評分≥1)至實驗結束評分的總和。累積疾病指數[4]計算方法為累積疾病指數為組內每只小鼠每天臨床評分總和的均數。

2.2標本采集 于免疫后28 d，采用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后取脾臟，制備成單個核細胞懸液。同時，動物用生理鹽水灌注，再用4%多聚甲醛行組織固定，分離脊髓，OCT(optimal cutting temperature)包埋劑包埋，于液氮中冷凍，做冰凍切片，厚度為10 μm， 行髓鞘染色和HE染色。

2.3HE染色 將切片水中浸泡2 min,蘇木精染色4 min,快速水洗，0.5%鹽酸乙醇分化15 s，0.5%伊紅30 s, 快速水洗,梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.4髓鞘染色 取切片于70%乙醇中浸泡15 min，浸于固藍液中，57℃孵育24 h，于95%乙醇溶液浸洗10 min，去離子水浸洗5 min，0.05%碳酸鋰快速浸洗10 s，70%乙醇分化至灰質與白質能夠清晰辨別，去離子水浸洗5 min，梯度乙醇脫水各2 min，二甲苯透明2次，各5 min，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

2.5流式細胞術檢測 小鼠脾細胞懸于50 μL 0.1%皂苷(saponin)/1%BSA-PBS破膜劑或1%BSA-PBS緩沖液中，分別加1 μL流式抗體，包括Flour-488-CD11b、PE-IL-10、PE-CD16/32和PE-CD206抗體，室溫避光20 min。PBS洗2次，各加500 μL PBS，上流式細胞儀檢測。

2.6ELISA法檢測IL-1β、IL-10和TNF-α 小鼠脾細胞培養48 h后，收集上清液置-80 ℃待檢測。IL-1β、IL-10和TNF-α的濃度采用商業ELISA試劑盒，具體檢測方法參照試劑盒說明書。參考各因子的標準曲線計算其含量，結果以ng/L表示。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)，采用GraphPad Prism 5.0軟件分析，組間比較采用t檢驗或Mann-WhitneyU檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1法舒地爾口服對EAE小鼠的療效比較

EAE小鼠于免疫后第10天到第14天陸續發病，表現為精神萎靡、食欲減少、皮毛不光滑和體重減輕等，直至發生肢體癱瘓，最高分達4.5分，平均發病天數為免疫后第(12.75±2.25)天，而法舒地爾治療組平均發病天數為免疫后第(15.57±2.82)天，與EAE對照組平均發病天數相比明顯推遲，差異有統計學意義(P<0.05)。EAE對照組平均高峰期評分為2.75±1.00，而法舒地爾治療組為1.43±0.45，與EAE對照組相比明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。EAE對照組累積臨床評分為28.63±11.09，而法舒地爾治療組累積臨床評分為12.71±4.92，較EAE對照組明顯降低，有統計學意義(P<0.01)。EAE對照組累積疾病指數為1.56±0.56，而法舒地爾治療組累積疾病指數為0.71±0.24，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1A。EAE對照組臨床癥狀的加重可伴體重減輕，法舒地爾治療小鼠可明顯減緩體重的減輕(P<0.05或P<0.01)，見圖1B。

Figure 1. The incidence of the mice in EAE group and fasudil intervention group. A: clinical score; B: body weight. The comparison in each time point was separately analyzed by Mann-WhitneyUtest.Mean±SD.n=7.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

圖1EAE組和法舒地爾組發病情況

2法舒地爾口服減少EAE中樞炎癥細胞浸潤和髓鞘的脫失

HE染色顯示，與法舒地爾治療組相比，EAE對照組白質出現大量炎癥細胞浸潤，其中腰膨大部位明顯，炎癥浸潤細胞計數為368.00±57.07，而法舒地爾治療組為75.67±9.29，有統計學意義(P<0.05)，見圖2。髓鞘染色顯示EAE對照組出現大量髓鞘脫失，而法舒地爾治療組髓鞘脫失被有效抑制。EAE對照組髓鞘脫失與白質面積比值為(25.6±8.6)%，法舒地爾組為(4.1±1.3)%，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3法舒地爾對脾巨噬細胞的影響

流式細胞術檢測M1型巨噬細胞的標志CD16/32和M2型巨噬細胞的標志CD206和IL-10,結果發現，法舒地爾治療并不能明顯影響M1型細胞CD16/32的表達，但可以明顯增加M2型細胞CD206和IL-10的表達，差異有統計學意義(P<0.01或P<0.05)。計算M1型表面標志CD16/32和CD206表達的比值，發現法舒地爾組表達比值明顯低于EAE對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。上述結果提示法舒地爾口服治療可以誘導炎癥M1型巨噬細胞向抗炎的M2型轉化。

Figure 2. The Luxol fast blue myelin staining and HE staining of mouse spinal cord in EAE group and fasudil intervention group.Mean±SD.n=7.*P<0.05vsEAE group.

圖2EAE組和法舒地爾組小鼠脊髓HE染色和髓鞘染色及統計

Figure 3. The effect of fasudil on the phenotype of splenic macrophages. Cells were stained with macrophage marker CD11b and M1/M2 markers, and the polarization of M1/M2 was analyzed using flow cytometry. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsEAE group.

圖3法舒地爾對脾巨噬細胞表型的影響

4法舒地爾對細胞因子的影響

采用ELISA法對培養48 h后脾細胞上清液IL-1β、IL-10和TNF-α進行檢測。法舒地爾治療組脾細胞培養上清液中IL-1β和TNF-α濃度明顯低于EAE對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，而IL-10的濃度則增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。這一結果表明，法舒地爾治療可有效抑制EAE小鼠外周免疫性炎癥反應。

Figure 4. Fasudil inhibited the production of inflammatory cytokines.Mean±SD.n=4.*P<0.05vsEAE group.

圖4法舒地爾抑制炎癥因子的釋放

討 論

鑒于MS的病因及發病機制的復雜性[5]，目前針對MS尚缺乏有效的治療。MS的治療多采取靜脈滴注或皮下、肌內注射類固醇藥物、免疫修飾藥物如醋酸格拉默和IFN-β，免疫調節藥物如免疫球蛋白等。這類藥物雖對MS的病程有所緩解，但其價格昂貴，遠期使用副作用大，如醋酸格拉默易引起肝功能異常、流感樣病變，IFN-β易引起局部皮膚紅腫及全身反應明顯[6]。而且靜脈、皮下注射給藥途徑長期使用對患者造成不便和痛苦，并導致患者的依從性差。雖然目前已有MS的口服藥物，但價格非常昂貴，病人使用受到很大局限。因此，探討新的安全可靠、簡捷有效的口服治療MS藥物具有重要的臨床實際意義。

法舒地爾作為一種選擇性Rho激酶抑制劑，臨床上主要治療蛛網膜下腔出血后血管痙攣。由于其副作用小、作用靶點多，在神經退行性疾病中可能表現良好的治療潛能。Sun等[7]研究發現通過腹腔注射法舒地爾可減少EAE小鼠中樞神經系統的炎癥細胞浸潤和外周特異性淋巴細胞的數目。Feske等[8]指出，法舒地爾可以促進EAE小鼠神經軸突再生，減低血管通透性，抑制炎癥細胞聚集和炎癥因子的釋放。我們前期研究發現，法舒地爾腹腔注射可明顯改善EAE小鼠臨床癥狀，并可下調NF-κB[9]和抑制occludin的表達[10]，減少炎癥浸潤和髓鞘脫失。但是，法舒地爾的靜脈劑型不適合MS病人的長期使用，本實驗通過法舒地爾的口服途徑，研究其對EAE的治療效果。結果顯示法舒地爾口服可延遲EAE的發病，緩解EAE的癥狀，降低脊髓的炎癥反應和髓鞘脫失。目前關于探討法舒地爾給藥途徑的實驗研究大多是腹腔注射，而法舒地爾口服給予治療EAE的研究尚無文獻報道。考慮到MS是一個需要長期治療的疾病，因此口服治療尤其顯得重要和必要。口服途徑作為臨床上最常用的給藥方式，與臨床靜脈給藥相比，具有安全、簡便、患者依從性好等優點。盡管口服治療有效，但其效果似乎不如腹腔給予，我們仍將進一步研究試圖提高其治療的效果，為今后臨床法舒地爾口服治療MS提供了可行性。

已有研究表明，巨噬細胞在EAE的發生發展中具有關鍵作用[11]。現有研究證實巨噬細胞可分為M1和M2型，M1型由Th1細胞分泌的致炎癥因子如IFN-γ、IL-6、TNF-α誘導激活，高表達IL-1β、TNF-α等促炎因子，促進免疫炎癥反應。而M2型可由Th2細胞分泌抑炎因子如IL-10、TGF-β1等選擇性激活，可高表達IL-10和TGF-β1抑制炎癥。正常情況下，這兩類細胞通過分泌細胞因子相互制約以致動態平衡，達到免疫穩態的效果。目前的研究提示EAE的發病機制與M1和M2之間細胞因子分泌失衡有關[12]。細胞因子微環境決定巨噬細胞M1和M2的極化。已有體外實驗證實，法舒地爾可直接促進炎癥MI巨噬細胞向M2轉化[13]。本實驗結果顯示，法舒地爾口服治療雖不能影響M1型表面標志CD16/32的表達，但可以明顯增加M2型表面標志CD206和細胞因子IL-10表達，其平衡明顯偏向M2表型，即表現為M1與M2巨噬細胞比值降低。這些結果提示法舒地爾口服治療可誘導炎癥M1巨噬細胞向抗炎M2型細胞分化。這一結果很可能與我們觀察到的法舒地爾口服治療減低炎癥細胞因子分泌密切相關。

綜上所述，法舒地爾口服治療可以有效改善EAE的臨床癥狀，抑制炎癥病灶并改善髓鞘脫失，其作用機制可能與調節巨噬細胞的極性，抑制系統免疫炎癥反應有關。進一步的深入研究仍然必要，以便為今后臨床使用法舒地爾口服治療提供新的思路和奠定實驗依據。

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Oraladministrationoffasudilhydrochloridesuppressesdevelopmentofexperimentalautoimmuneencephalomyelitisinmice

ZHANG Hui1,2, ZHANG Hai-fei2,3, LI Yan-hua2, LIU Chun-yun2, YU Jie-zhong2, DING Zhi-bin1,2, YANG Xing-wang2,5, YANG Wan-fang5, LI Jun-lian5, FENG Qian-jin5, FENG Ling2, XIAO Bao-guo2,4, MA Cun-gen1,2,5

(1DepartmentofNeurology,theFirstClinicalMedicalCollege,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,Datong037009,China;3DepartmentofNeurology,theFifthPeople’sHospitalofDatongCity,Datong037009,China;4InstituteofNeurology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200025,China;5DepartmentofEncephalopathy,NationalMajorClinicalDepartmentofMinistryofHealth,theThirdHospital,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Taiyuan030024,China.E-mail:macungen2001@163.com)

AIM: To explore the therapeutic effect of fasudil hydrochloride by the oral route on the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice and its possible mechanism.METHODSThe EAE model in female C57BL/6 mice was established by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 peptide(MOG35-55) immunization and the immunized mice were randomly divided into saline control group and fasudil intervention group, in which saline and fasudil were administered by the oral route once every day from post-immunization (PI) day 3 to day 27. Clinical score and body weight were recorded every other day. On PI day 28, the spinal cords were obtained for HE and myelin staining. The splenocytes were isolated and the expression of CD16/32, CD206 and interleukin (IL)-10 was analyzed by flow cytometry. The levels of IL-1β and tumor necrosis factor α (TNF-α) were detected by ELISA.RESULTSOral administration of fasudil delayed the onset of EAE, and attenuated the myelinoclasis of the model animals and the severity of EAE, accompanied by the phenotypic switch from M1 to M2 macrophages, the inhibition of the proinflammatory cytokine (IL-1β and TNF-α) production and the increase in IL-10 release.CONCLUSIONOral administration of fasudil exhibits therapeutic effect on the development of EAE possibly through switching M1 macrophages to M2 phenotype and inhibiting inflammatory responses in mice.

Fasudil; Oral administration; Experimental autoimmune encephalomyelitis; Macrophages; Cytokines

R320.54

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.026

1000- 4718(2013)11- 2060- 06

2013- 07- 22

2013- 09- 22

國家自然科學基金資助項目(No.81070957; No.81272163);山西中醫學院“2011計劃”培育計劃資助項目(No.2011PY-1);2013年度國家國際科技合作專項項目(No.2013DFA30700);山西省青年自然科學基金資助項目(No.2012021034-2);山西大同大學青年科學研究項目(No.2010Q6)

△通訊作者Tel: 0351-2272208; E-mail: macungen2001@163.com