脂肪組織基質血管組分移植對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心功能的影響*

莊 偉， 謝良地， 許昌聲， 王華軍， 沈逸華， 陳 明

(福建醫科大學附屬第一醫院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

脂肪組織基質血管組分移植對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心功能的影響*

莊 偉， 謝良地△， 許昌聲， 王華軍， 沈逸華， 陳 明

(福建醫科大學附屬第一醫院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

目的觀察脂肪組織基質血管組分(SVF)靜脈移植對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心功能的影響，并探討其可能的機制。方法膠原酶體外分離培養SD大鼠SVF，并用綠色熒光蛋白標記。雄性SD大鼠28只隨機分為正常對照組(n=8)、阿霉素對照組(n=10)和SVF治療組(n=10)；15 mg/kg阿霉素腹腔注射，每周2次，連續4周，建立大鼠心力衰竭模型；SVF治療組予以陰莖靜脈移植SVF(1×107/L細胞0.5 mL)，其余兩組給予等量PBS注射。移植4周后，經導管多導生理儀測定心功能；冰凍切片熒光顯微鏡檢測SVF在心肌組織中歸巢情況；免疫組化法檢測新生血管內皮標志物CD31的表達。結果(1)與阿霉素對照組相比，SVF治療組左室收縮壓峰值[LVSP，(135.65±21.58) mmHgvs(105.58±22.62) mmHg，P<0.05]、左室壓最大上升速率[+dp/dtmax，(4 815.65±566.24) mmHg/svs(3 535.50±465.28) mmHg/s，P<0.05]和左室壓最大下降速率[-dp/dtmax，(3 677.56±467.75) mmHg/svs(2 738.65±512.51) mmHg/s，P<0.05]均顯著增加，但仍低于正常對照組；(2)SVF治療組CD31免疫組化顯示細胞核染色及棕黃色顆粒沉著分布較阿霉素對照組均勻，每個視野的血管數顯著增多。結論SVF移植可明顯改善阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心功能，部分機制可能與其促進心肌組織血管再生有關。

基質血管組分； 阿霉素； 心力衰竭； 血管內皮； 大鼠

來源于中胚層的脂肪組織去除成熟脂肪細胞后獲得的基質血管組分(stromal vascular fraction，SVF)含有豐富的具干細胞特性的細胞。SVF作為一種混合細胞群，其中除了脂肪間充質干細胞外，可能還含有少許其它成分的細胞[1]。研究表明，骨髓間充質干細胞移植能夠改善阿霉素誘導的心力衰竭大鼠模型的心功能[2]。SVF移植也能使局部心肌病變如心肌梗死所致的心力衰竭大鼠心功能得到一定的改善[3]。但SVF對于彌漫性心肌病變所致的心力衰竭心功能的影響尚不甚清楚。本研究通過體外分離培養大鼠SVF，靜脈移植到阿霉素誘導的心力衰竭大鼠模型體內，觀察對心功能的影響，并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1實驗動物及主要試劑

200～250 g清潔級SD雄性大鼠，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。細胞培養用DMEM培養基、胎牛血清(fetal calf serum，FCS)和胰蛋白酶(Gibco);I型膠原酶(Sigma)；CD31Ⅰ抗和辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標記Ⅱ抗(Santa Cruz)；其它常用試劑均為分析純。

2主要方法

2.1體外SVF的分離培養 參照文獻方法[4]進行大鼠SVF的分離培養。無菌條件下，取大鼠腹部脂肪組織，0.1%膠原酶消化，用300目過濾，加入10%FCS培養基，3 500 r/min離心，取上清中細胞，加入15%FCS培養基于培養箱中。第2 d更換培養基繼續培養，3 d后觀察細胞生長，待細胞長至80%～90%匯合時用0.25%胰酶消化傳代，取3～6代細胞行細胞移植。

2.2體外SVF的標記 利用綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)細胞標記技術[5]，待細胞生長60%～70%匯合，用0.25%胰酶消化并行細胞計數，更換無血清培養基，加GFP標記腺病毒載體(MOI=50，正陽公司提供)轉染，3 d后熒光顯微鏡下觀察感染標記病毒的SVF熒光表達。

2.3心力衰竭大鼠動物模型的建立及分組 參照既往文獻方法用阿霉素誘導建立心力衰竭大鼠模型[6]。大鼠隨機分成阿霉素對照組(n=10)、SVF治療組(n=10)和正常對照組(n=8)，前兩者腹腔注射15 mg/kg阿霉素，每周2次，連續4周，后者給予等體積的生理鹽水。SVF治療組腹腔注射完阿霉素2周后，將經過GFP標記的SVF消化離心后，用PBS制成細胞懸液(1×107/L)，經陰莖靜脈注入0.5 mL；其余兩組單純注射PBS，4周后測定心功能。

2.4經導管多導生理儀測定大鼠心功能 移植4周后，用經導管多導生理儀測定大鼠心功能的方法[7]，測得左室收縮壓峰值(left ventricular peak systolic pressure,LVSP)和左室壓最大上升/下降速度(left ventricular pressure maximal rise/decline rate,±dp/dtmax)。

2.5熒光標記的SVF在心肌組織中的歸巢 心功能測定后，運用本研究所前期方法[8]，冰凍切片熒光顯微鏡下觀察SVF移植后在心肌組織中的歸巢情況。

2.6SVF移植對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心肌組織中新生血管內皮標志物CD31表達的影響 取出大鼠心臟10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規脫蠟，PBS漂洗10 min，加Ⅰ抗(1∶200)4 ℃冰箱過夜，PBS漂洗5 min/次，共3次，加Ⅱ抗(1∶100)37 ℃1.5 h，PBS漂洗5 min/次，共3次，加DAB顯色，鏡下觀察，蘇木素復染，拍照。

3統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示；采用SPSS 13.0軟件包統計；多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1GFP-腺病毒轉染標記SVF

轉染3 d后熒光顯微鏡下觀察熒光表達，可見大量綠色熒光標記的SVF細胞，見圖1。

Figure 1. Green fluorescence expression of SVF transfected with GFP-adenovirus (×200). A：SVF under visible light microscope; B： SVF in the same visual field of fluorescence microscope using an excitation wavelength of 490 nm, most of cells expressed green fluorescence.

圖1GFP-腺病毒轉染SVF后綠色熒光觀察

2SVF移植4周后心肌組織歸巢檢測

SVF移植4周后，心肌冰凍切片熒光顯微鏡下觀察SVF細胞，心肌組織及其血管壁可見綠色熒光SVF細胞歸巢定植，見圖2。

3SVF對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠左心功能的影響

與正常對照組相比，阿霉素對照組LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均明顯降低(P<0.01)；與阿霉素對照組相比，SVF治療組LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著增加(P<0.05)，見表1。

4SVF對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠心肌組織中血管內皮CD31表達的影響

心肌組織CD31免疫組化顯示(棕黃色顆粒提示CD31陽性)，正常對照組心肌組織細胞核染色及棕黃色顆粒沉著呈均勻分布；阿霉素對照組可見心肌組織細胞核深染且分布不均，并出現聚集現象，棕黃色顆粒減少；SVF治療組細胞核染色較為均勻，棕色顆粒增多且均勻分布，見圖3。與正常對照組相比，阿霉素對照組每個視野的血管數顯著減少(P<0.05)；與阿霉素對照組相比，SVF治療組每個視野的血管數顯著增多(P<0.05)，見圖4。

Figure 2. Green fluorescence expression of SVF marked with GFP-adenovirus in myocardium 4 weeks after transplantation (frozen section, ×100). A,B:blood vessel;C,D: myocardium.A,C: visible light microscope; B,D: fluorescence microscope using an excitation wavelength of 490 nm.

圖2GFP-腺病毒標記SVF移植4周后心肌組織熒光表達

表1 SVF對阿霉素誘導的心力衰竭大鼠左心功能指標的影響

HR: heart rate; LVSP: left ventricular peak systolic pressure; +dp/dtmax: left ventricular pressure maximal rise rate; -dp/dtmax: left ventricular pressure maximal decline rate.**P<0.01vsnormal control;#P<0.05vsadriamycin control.

Figure 3. CD31 positive expression in rat myocardium of diffe-rent groups (immunohistochemical staining, ×100). The buffy deposits in myocardium indicated CD31 positive expression. A:normal control group; B: adriamycin control group; C:SVF treatment group.

圖3免疫組化檢測各組心肌組織CD31陽性表達

討 論

心力衰竭是多種心臟疾病進展到嚴重階段的共同歸宿。如何減輕和修復心肌損害，改善心力衰竭患者的心功能，一直為臨床所關注。干細胞為探索治療心力衰竭的方法提供了除藥物、器械和心臟移植之外另一可能的途徑。

前期的研究顯示，SVF通過外周靜脈移植，能在大鼠的多個特定器官歸巢定植，包括心、肺、肝、腎、脾等，并分化為內皮細胞[8]。本研究中，SVF 經陰莖靜脈移植，GFP標記示蹤冰凍切片顯示能夠在心肌組織中歸巢定植。相對于正常對照組，阿霉素對照組心力衰竭模型大鼠血流動力學檢測顯示左心室收縮功能指標LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著降低，提示心功能下降，心力衰竭大鼠建模成功；其心肌細胞彌漫性病變，內皮細胞標志物CD31密度降低，心肌組織血管分布明顯減少。相對于阿霉素對照組，SVF治療組LVSP、+dp/dtmax和-dp/dtmax均顯著增加，提示SVF移植改善了心力衰竭大鼠的心功能；同時發現，其心肌組織CD31密度增高，顯示心肌組織新生血管內皮增多。

Figure 4. The number of blood vessels per visual field in myocardium of different groups. Mean±SD.*P<0.05vsnormal control;#P<0.05vsadriamycin control.

圖4各組心肌組織每個視野的血管數比較

已有研究發現，在SVF移植治療大鼠后肢缺血模型和心肌梗死模型中，新生毛細血管的密度明顯增高，血運改善。其作用機制可能為在微環境的作用下，移植的SVF中含有的內皮前體細胞，或脂肪間充質干細胞分化為血管內皮細胞[4]。有動物實驗研究證明，SVF可以分泌血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、促血管生成素-1以及單核細胞趨化蛋白等細胞活性因子[9]。尤其在缺氧條件下，VEGF分泌明顯增加[10]。這些細胞因子可以刺激病變區域心肌組織新生血管的形成，同時發揮抗細胞凋亡作用，并趨化其它細胞參與血管內皮和心肌的修復[11]。本研究發現，經SVF移植后，心肌組織內血管密度顯著增高，提示SVF也可能通過類似機制，在彌漫性的心肌病變中促進心肌組織血管再生，進而有助于SVF治療組的心功能改善。但SVF移植促進血管再生，是以分化為血管內皮起主要作用，還是以旁分泌功能促進血管內皮增生為主要作用，有待于進一步的研究比較。

另有體外和在體動物實驗研究發現，脂肪間充質干細胞可以分化為心肌樣細胞[12]，也有人認為VEGF是干細胞自發分化為心肌細胞的關鍵因子之一[13]。因此，SVF定植到病變區，其中的脂肪間充質干細胞也可能分化為心肌細胞，從而有助于改善心力衰竭大鼠的心功能[14]，這需要進一步的研究證實。

SVF具有獨特的免疫學特征，不表達或低表達主要組織相容性復合物和共刺激分子，同時具有一定的免疫抑制性[15]，從而大大降低了產生免疫排斥的可能性。而且個體自身的脂肪組織來源豐富，取材方便，創傷不大，通過自身脂肪組織提取SVF進行自體移植，完全規避了免疫排斥的風險，是理想的干細胞來源。

綜上所述，SVF移植可改善阿霉素誘導的心力衰竭大鼠的心功能。心功能的改善可能部分與其促進心肌組織血管再生有關。盡管目前仍有更多的機制問題需要進一步的探討，但這為臨床上使用患者自身的脂肪組織提取干細胞應用于心力衰竭的治療，提供了一種可能。

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Effectsoftransplantationofadiposestromalvascularfractiononcardiacfunctioninadriamycin-inducedheartfailurerats

ZHUANG Wei, XIE Liang-di, XU Chang-sheng, WANG Hua-jun, SHEN Yi-hua, CHEN Ming

(TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,FujianHypertensionResearchInstitute,Fuzhou350005,China.E-mail:ldxie@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of transplantation of adipose stromal vascular fraction (SVF) on the cardiac function in adriamycin-induced heart failure rats.METHODSSVF was isolated from adipose tissue of a Sprague-Dawley (SD) rat by collagenase digestion and marked with green fluorescent protein (GFP)invitro. Twenty-eight SD rats were randomized into normal control group (n=8), adriamycin control group (n=10) and SVF treatment group (n=10). Adriamycin at dose of 15 mg/kg was intraperitoneally injected into the rats twice a week for 4 weeks to induce heart failure. SVF cells (0.5 mL, 1×107/L) were injected via penis vein, and PBS vehicle was injected into the control animals in the same way. Four weeks later, the cardiac function was determined by multichannel physiologic recorder via cardiac catheterization. SVF was demonstrated in the myocardium by frozen section fluorescence microscopy. The CD31 expression was determined by an immunohistochemical test.RESULTSCompared with adriamycin control group, SVF transplantation increased left ventricular peak systolic pressure [LVSP, (135.65±21.58) mmHgvs(105.58±22.62) mmHg,P<0.05], left ventricular pressure maximal rise rate [+dp/dtmax, (4 815.65±566.24) mmHg/svs(3 535.50±465.28) mmHg/s,P<0.05], and left ventricular pressure maximal decline rate [-dp/dtmax, (3 677.56±467.75) mmHg/svs(2 738.65±512.51) mmHg/s,P<0.05]. The results of the CD31 immunohistochemical test showed that the nuclear staining and granule distribution were more uniform, and the number of blood vessels per visual field increased in SVF treatment group as compared with adriamycin control group (P<0.05).CONCLUSIONSVF transplantation improves the cardiac function in the rat model of heart failure, possibly and partly through the promotion of myocardial neovascularization.

Stromal vascular fraction; Adriamycin; Heart failure; Vascular endothelium; Rats

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.020

1000- 4718(2013)11- 2030- 04

2013- 07- 08

2013- 09- 16

福建醫科大學苗圃科研基金資助項目(No.2010MP008)；福建省衛生廳青年科研基金資助項目(No. 2009-2-14)

△通訊作者 Tel: 0591-83357199; E-mail: ldxie@hotmail.com