促紅細胞生成素通過激活ERK和p38 MAPK抑制小鼠骨髓間充質干細胞成脂分化*

劉革修， 朱錦燦， 陳小宇， 祝愛珍， 劉成成， 賴 菁

(暨南大學血液病研究所，廣東 廣州 510632)

促紅細胞生成素通過激活ERK和p38 MAPK抑制小鼠骨髓間充質干細胞成脂分化*

劉革修△， 朱錦燦， 陳小宇， 祝愛珍， 劉成成， 賴 菁

(暨南大學血液病研究所，廣東 廣州 510632)

目的探討促紅細胞生成素(EPO)是否抑制小鼠骨髓間充質干細胞(MSCs)分化為脂肪細胞及其機制。方法分離提取小鼠骨髓MSCs，用3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和地塞米松聯合誘導成脂分化，實驗組加入不同濃度EPO干預，誘導分化第20天油紅O染色觀察并進行定量分析細胞分化程度；MTT法觀察不同濃度EPO對MSCs增殖能力的影響。實時熒光定量PCR檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、CCAAT/增強子結合蛋白α(C/EBPα)、脂肪酸結合蛋白4(FABP4)和脂聯素mRNA表達水平；Western blotting檢測PPARγ及細胞外信號調節激酶(ERK)和 p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)磷酸化水平。結果誘導分化20 d，EPO能顯著抑制MSCs的成脂分化，降低油紅O染色后的吸光度值，誘導分化過程中各濃度的EPO不影響MSCs增殖活性。EPO能夠下調成脂過程中PPARγ、C/EBPα、FABP4和脂聯素mRNA表達，增加分化過程中ERK、p38 MAPK及PPARγ蛋白磷酸化。結論EPO可能通過增加p38 MAPK和ERK蛋白磷酸化，下調PPARγ、C/EBPα、FABP4和脂聯素mRNA表達, 從而抑制MSCs成脂分化。

促紅細胞生成素； 間充質干細胞； 信號通路

在哺乳動物體內，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟及胎肝產生的糖蛋白。低氧條件下，EPO與其受體(EPO receptor, EPO-R) 結合發揮作用，促進紅系祖細胞增殖、分化為成熟紅細胞，以增加循環中紅細胞數量[1]。目前臨床上主要用于治療外科手術、慢性腎功能衰竭、化療等所導致的貧血。最近研究表明，EPO-R廣泛分布于脾臟、肺、 大腦、 心肌細胞等非造血組織，意味著其具有多種非造血活性[2-3]。EPO對非造血細胞的作用包括促進內皮細胞增殖[4]，保護心肌梗死引起的心肌損傷[5], 抑制血管緊張素Ⅱ誘導的心室重塑[6]，改善受損神經細胞的恢復[7]。 另外，EPO能夠通過減少NF-κB表達，抑制炎癥因子，促進骨折愈合[8]。Hojman等[9]還證明EPO能夠抑制小鼠高脂飲食導致的體重增加[9]，缺乏Epo-R表達的小鼠更易導致肥胖和胰島素抵抗，并且通過細胞實驗證實了EPO能直接抑制3T3-L1前體脂肪細胞的分化[10]，但尚未有研究證實其對骨髓間充質干細胞 (mesenchymal stem cells, MSCs)成脂分化的影響。本研究觀察EPO是否抑制小鼠骨髓間充質干細胞分化為脂肪細胞，并對其機制進行初步探討。

材 料 和 方 法

1材料

6周齡雄性昆明小鼠購自中山大學實驗動物中心；DMEM培養基、胰蛋白酶購自HyClone; 重組人促紅細胞生成素(rhEPO) 購自沈陽三生制藥股份有限公司；胎牛血清、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素和油紅O染液購自Gibco; 細胞茜素紅鈣染色試劑盒購自上海杰美基因醫藥有限公司; 噻唑藍購自科昊公司; RNAiso Reagent、cDNA 合成試劑盒和RT-PCR試劑盒購自Toyobo; 鼠抗鼠GAPDH多克隆抗體、ECL化學發光液購自聯科生物公司；兔抗鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)、p-PPARγ、細胞外信號調節激酶 42(extracellular signal-regulated kinase 42，ERK42)、p-ERK42、ERK44、p-ERK44、p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)和p-p38 MAPK抗體購自Cell Signaling Technology; 辣根過氧化物酶標記抗鼠Ⅱ抗和辣根過氧化物酶標記羊抗兔Ⅱ抗購自Santa Cruz。

2方法

2.1小鼠骨髓間充質干細胞的分離培養 取6周齡雄性昆明小鼠利用頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡2 min，分離兩側股骨，將骨表面附有的肌肉及肌筋膜等清除干凈。將股骨斷開, 用1 mL 注射器抽取DMEM完全培養基反復沖洗骨髓腔，直至骨髓腔發白。收集細胞轉移至15 mL的離心管中，800 r/min離心5 min，棄上清，再加入培養液重懸細胞，約5×106個細胞接種于25 cm2的培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。24 h后換液以去除懸浮細胞及雜質，此后每隔3 d換液1次，顯微鏡下觀察細胞生長狀況，直至細胞接近80%匯合時進行傳代。取第3代細胞進行MSCs鑒定：成骨分化采用茜素紅染色、成脂分化細胞采用油紅O染色。

2.2MSCs的成脂誘導分化 取P3代MSCs，培養至完全融合后2 d 開始誘導分化。即用含0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、5 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松的DMEM完全培養液培養3 d后，再換用含5 mg/L胰島素的DMEM完全培養液培養1 d。如此循環5個周期，每次換液時根據實驗需要加入相應濃度的EPO。

2.3油紅O染色 誘導分化20 d后細胞用PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定30 min，油紅O染液室溫孵育60 min, 然后用PBS漂洗3次, 倒置顯微鏡下觀察脂滴形成情況。用異丙醇萃取油紅O, 5 min后通過酶標儀測量520 nm處的吸光度值。

2.4MTT檢測細胞增殖活性 將MSCs以5×104well的密度接種于96孔板，用成脂誘導分化液培養，加入不同濃度EPO(0、0.1、1、5、10 kU/L)的培養液培養72 h。每孔加入5 g/L MTT 工作液20 μL，于37 ℃培養箱繼續孵育4 h，每孔加入150 μL二甲基亞砜, 振蕩5 min后在酶標儀上測量490 nm處的吸光度。

2.5實時熒光定量PCR檢測成脂分化基因的表達 收集各組成脂誘導分化細胞，用Trizol試劑提取總RNA, 反轉錄合成cDNA后，采用實時熒光定量PCR 法檢測成脂相關基因mRNA表達，熒光定量PCR 引物見表1。PCR反應條件為預變性93 ℃ 3 min，93 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，最后72 ℃ 10 min，共45個循環。GAPDH作為內參照，分別計算各組2-ΔΔCt，用以表示PPARγ、CCAAT/增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α，C/EBPα)、脂肪酸結合蛋白4(fatty acid binding protein 4，FABP4)和脂聯素mRNA 相對表達量。

2.6Western blotting 收集各組成脂誘導分化細胞，PBS漂洗2遍，細胞裂解液4 ℃裂解細胞30 min，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，BCA蛋白濃度測定試劑檢測蛋白含量。取30 μg蛋白樣品加上樣緩沖液煮沸變性后，經10% SDS-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上, 含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。Ⅰ抗孵育, 于4 ℃過夜，用TBST洗膜3次，加入Ⅱ抗室溫孵育1 h后，再用TBST洗膜3次，ECL化學發光顯影。

表1實時熒光定量PCR的引物序列

Table 1. The primer sequences for real-time fluorescence quantitative PCR analysis

NamePrimersequence(5’-3’)GAPDHForward:AGGTCGGTGTGAACGGATTTGReverse:AGGTCGGTGTGAACGGATTTGPPARγForward:GGAAGACCACTCGCATTCCTTReverse:GTAATCAGCAACCATTGGGTCAC/EBPαForward:CAAGAACAGCAACGAGTACCGReverse:GTCACTGGTCAACTCCAGCACFABP4Forward:AAGGTGAAGAGCATCATAACCCTReverse:TCACGCCTTTCATAACACATTCCAdiponectinForward:ACCACTATGATGGCTCCACTReverse:GGTGAAGAGCATAGCCTTGT

3統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0軟件處理數據，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1小鼠骨髓間充質干細胞的分離培養

骨髓MSCs細胞接種24 h后，大部分細胞仍然懸浮，少量細胞貼壁生長，細胞生長緩慢，3～4 d后增殖加快，1周左右接近融合。通過常規貼壁法分離純化骨髓間充質干細胞，第3代細胞形態單一，呈梭形，細胞增生活躍。第4代細胞進行成骨成脂分化鑒定顯示可以分化為成骨細胞和脂肪細胞,見圖1。

Figure 1. MSCs isolated from mouse bone marrow(×200). A:the primary cells; B: the fourth generation cells; C:oil red O staining after adipogenic induction; D: alizarin red staining after osteogenic inducting differentiation.

圖1分離培養的小鼠MSCs

2EPO對MSCs成脂分化的影響

為了檢測EPO對成脂分化的影響，誘導分化過程中加入不同濃度EPO(0、0.1、1、5和10 kU/L)，20 d 后油紅O染色評估分化程度。如圖2所示，EPO抑制MSCs的成脂分化，隨著藥物濃度增加MSCs中被染色的脂滴含量明顯下降。用異丙醇萃取油紅O后，EPO濃度和油紅O萃取后的A值呈明顯的負相關，其中，5 kU/L和10 kU/L EPO能顯著抑制MSCs的成脂分化(P<0.05)。根據上述結果，本文選取5和10 kU/L EPO作為后面實驗研究的作用濃度。

Figure 2. Oil red O staining and quantification after adipogenic induction of differentiation for 20 d(×200).A: EPO 0 kU/L; B: EPO 0.1 kU/L; C: EPO 1 kU/L; D: EPO 5 kU/L;E: EPO 10 kU/L.Mean±SD.n=5.*P<0.05vsA.

圖2MSCs成脂誘導分化20d后油紅O染色及定量

3EPO對MSCs增殖的影響

為了驗證EPO是否存在細胞毒性，融合后的MSCs用成脂誘導分化液培養，加入不同濃度EPO(0、0.1、1、5和10 kU/L)干預，連續觀察3 d，采用MTT法檢測，結果顯示在各時點各濃度EPO對MSCs增殖無顯著影響, 見圖3。

Figure 3. Effects of different concentrations of EPO on the proli-feration of MSCs. Mean±SD.n=5.

圖3不同濃度EPO對MSCs增殖的影響

4EPO對MSCs成脂相關基因mRNA表達的影響

用5和10 kU/L干預MSCs成脂分化過程，觀察分化第14 d MSCs的成脂相關基因表達情況，發現EPO能夠下調成脂過程中PPARγ、C/EBPα、FABP4和脂聯素mRNA表達,差異均有統計學意義(P<0.05), 見圖4。

Figure 4. Relative PPARγ,C/EBPα,FABP4 and adiponectin mRNA levels in MSCs without and with EPO treatment (0,5 and 10 kU/L) during differentiation (day 14). Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 kU/L.

圖4MSCs成脂分化過程中，不同濃度EPO對PPARγ、C/EBPα、FABP4和脂聯素mRNA表達的影響

5EPO對MSCs向成脂細胞分化過程中ERK和p38MAPK的影響

MSCs成脂誘導分化過程中加入EPO(5和10 kU/L)處理后，上調了ERK42、ERK44和p38 MAPK磷酸化活性，同時PPARγ的磷酸化也增加，但總的PPARγ表達下降，見圖5。

討 論

骨髓間充質干細胞又稱為骨髓基質細胞，與造血干細胞、造血祖細胞等構成骨髓造血微環境，調控機體的造血生理[11]。MSCs具有多向分化潛能，在骨髓腔中可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等。Naveiras等[12]證明了骨髓中的脂肪細胞對造血有負性調控作用，骨髓大量的脂肪細胞存在能夠抑制造血干細胞移植后的造血重建，而抑制小鼠化療后的骨髓脂肪則能促進造血恢復[13]。另一方面，絕經前女性的慢性失血能刺激骨髓造血，而骨質疏松這種骨髓脂肪化疾病多發生于絕經后女性[14]，提示機體內骨髓的造血也有可能反作用于骨髓微環境。EPO作為機體內最重要的促進紅細胞分化成熟的細胞因子，很有可能參與骨髓微環境的調節。已有研究證實了EPO通過結合表達于MSCs表面的EPO受體，能夠直接促進MSCs的成骨分化[15]，而MSCs的成骨分化和成脂分化是相互抑制相互平衡的調節過程。根據上述依據，所以我們推測EPO能夠抑制骨髓MSCs成脂分化。

Figure 5. Effects of EPO on the expression and phosphorylation of ERK42, ERK44, p38 MAPK and PPARγ. Mean±SD.n=5.*P<0.05vs0 kU/L.

圖5在MSCs成脂細胞分化過程中，EPO對ERK、p38MAPK和PPARγ表達及磷酸化的影響

通過油紅O染色及其定量分析，我們發現EPO能夠抑制MSCs的成脂分化，其中，5和10 kU/L EPO的抑制作用有統計學意義。隨后我們用MTT法檢測EPO對成脂誘導培養的MSCs是否具有細胞毒作用，結果顯示在各時點各濃度EPO對MSCs增殖無影響，所以我們推測EPO對成脂分化過程中的MSCs沒有直接細胞毒性作用。

MSCs成脂分化是一個伴隨多種轉錄因子及脂肪細胞特異性基因表達的過程[16]。為了進一步驗證EPO對MSCs成脂分化的影響，我們分析了多種成脂基因的表達水平。其中，PPARγ和C/EBPα是成脂分化中最關鍵的轉錄因子，它們協同作用調控著成脂分化中各種特異性因子的表達[17]，而FABP4和脂聯素則是分化后期脂肪細胞表達的特異性基因[18]，熒光定量PCR的結果顯示EPO顯著抑制了 PPARγ、C/EBPα、 FABP4 和脂聯素mRNA表達。

MAPK信號途徑參與調節脂肪形成的各個階段，分化前ERK和p38 MAPK調節細胞克隆增殖。另外，ERK和p38 MAPK對啟動前脂肪細胞的分化過程是必需的，而在脂肪細胞成熟過程中這兩條途徑必須關閉，可能是由于PPARγ是ERK作用的底物，ERK磷酸化使PPARγ磷酸化增加，導致其活性下降[19-20]。另一方面，ERK和p38 MAPK是EPO受體下游的信號分子，于是我們推測EPO可能通過此信號通路發揮作用。通過研究發現EPO處理后的MSCs在分化過程中上調了ERK42、ERK44、p38 MAPK磷酸化活性，導致PPARγ的磷酸化增加，但總的PPARγ表達下降。這提示EPO通過ERK和p38 MAPK引起PPARγ磷酸化，調節成脂分化。

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ErythropoietininhibitsadipogenesisofmousebonemarrowmesenchymalstemcellsbyactivatingERKandp38MAPK

LIU Ge-xiu, ZHU Jin-can, CHEN Xiao-yu, ZHU Ai-zhen, LIU Cheng-cheng, LAI Jing

(InstituteofHematology,JinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:tliugx@jnu.edu.cn)

AIM: To explore the role of erythropoietin (EPO) in the differentiation of mouse bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) into adipocytes.METHODSThe mouse MSCs were cultured using routine methods. The cells were induced to differentiate by the cocktail medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine, insulin and dexamethasone, and the cells in the experiment group were treated with EPO. On the 20th day of induced differentiation, the cells were detected by oil red O staining. The mRNA expression of peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), CCAAT/enhancer-binding protein α (C/EBPα), fatty acid binding protien 4 (FABP4) and adiponectin were determined by real-time fluorescence quantitative PCR. The phosphorylation levels of PPARγ, extracellular signal-regulated kinase (ERK) and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK) were measured by Western blotting. MTT assay was adopted to detect the proliferation.RESULTSDuring adipogenic induction, EPO decreased lipid accumulation, and inhibited the adipogenic differentiation of MSCs without cytotoxicity. The mRNA expression of PPARγ, C/EBPα, FABP4 and adiponectin was significantly inhibited in induced cells. Moreover, EPO enhanced the activity of both p38 MAPK and ERK, and increased PPARγ phosphorylation.CONCLUSIONEPO significantly inhibits differentiation of mouse bone marrow-derived MSCs into adipocytesinvitrovia reducing the mRNA expression of PPARγ, C/EBPα, FABP4 and adiponectin, which may be mediated by the p38 MAPK and ERK signaling pathways.

Erythropoietin; Mesenchymal stem cells; Signaling pathway

R329.2+8

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.016

1000- 4718(2013)11- 2006- 05

2013- 07- 15

2013- 09- 26

國家自然科學基金資助項目(No.81270568)

△通訊作者 Tel: 020-85220262; E-mail: tliugx@jnu.edu.cn