RAD001通過誘導自噬提高人子宮內膜癌細胞對紫杉醇的敏感性*

王 煥, 李小毛, 劉穗玲, 李 田, 丁 杰

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

RAD001通過誘導自噬提高人子宮內膜癌細胞對紫杉醇的敏感性*

王 煥, 李小毛△, 劉穗玲, 李 田, 丁 杰

(中山大學附屬第三醫院婦產科，廣東 廣州 510630)

目的探討哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制劑RAD001通過誘導細胞自噬增強紫杉醇殺傷子宮內膜癌細胞作用的機制。方法用MTT法檢測RAD001對人子宮內膜癌Ishikawa和HEC-1A細胞的生長抑制作用，用激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3蛋白的聚集；用流式細胞術檢測細胞死亡；用Western blotting方法檢測LC3-I、LC3-II、mTOR及ULK1蛋白的表達；用靶向ULK1的siRNA特異性地抑制Ishikawa細胞中ULK1的表達，再檢測相關指標。結果RAD001可抑制Ishikawa和HEC-1A細胞的增殖，提高它們對紫杉醇的敏感性。RAD001誘導Ishikawa和HEC-1A細胞發生自噬及自噬性細胞死亡。RAD001通過抑制mTOR/p70S6K通路、上調ULK1誘導自噬，從而產生紫杉醇增敏作用。結論RAD001可以通過抑制mTOR信號通路，上調ULK1的表達，誘導自噬性細胞死亡的發生，從而提高子宮內膜癌細胞對紫杉醇的敏感性。

RAD001； Ishikawa細胞； HEC-1A細胞； 自噬； 紫杉醇

近年來，子宮內膜癌的發病率不斷上升，在西方國家已經占據女性生殖系統腫瘤發病率第1位[1]。 盡管早期的子宮內膜癌能夠被放療或手術等方法治愈，但進展期及轉移性子宮內膜癌的治療仍存在較大困難。因此，尋找新的有效的治療方案成為子宮內膜癌的研究熱點。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是PI3K/Akt 通路的下游分子,以mTOR 為靶點可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和逆轉腫瘤細胞對細胞毒藥物的耐藥性。細胞自噬(autophagy)是細胞在能量缺乏、饑餓等代謝壓力下的一種生理過程[2]，自噬與腫瘤發生發展密切相關。自噬一方面可以促進腫瘤細胞生存，另一方面，細胞自噬能抑制腫瘤發生[3]。自噬對腫瘤的作用依賴于腫瘤類型和不同的刺激處理，具體的機制尚未完全清楚。目前，mTOR與自噬關系的研究已取得較大進展。研究表明，通過抑制mTOR表達調控自噬對腫瘤治療可能有重要的意義[4-6]。

RAD001(everolimus)即40-O-(2-羥乙基)-雷帕霉素， 是一種新型的口服mTOR抑制劑。臨床前研究表明，對于一些耐藥細胞株，RAD001 與細胞毒藥物或其它靶點藥物聯用有抑制腫瘤細胞生長和促使其死亡的作用[7]。在PTEN基因缺失的前列腺癌細胞中，RAD001 可以誘導腫瘤細胞自噬和增強細胞對放療的敏感性[8]。RAD001 與細胞毒藥物聯用的一系列臨床試驗初步結果均提示RAD001 與化療藥聯用有相加或協同作用，且毒副反應并未明顯增加[9-10]。因此，本研究對RAD001促進人子宮內膜癌細胞自噬及Akt/mTOR通路在其中的作用機制進行了探討，旨在探索通過抑制 mTOR誘發自噬從而增敏化療、逆轉紫杉醇耐藥的可行性，希望為化療耐藥的患者尋找新的希望。

材 料 和 方 法

1材料

人子宮內膜癌細胞株Ishikawa及HEC-1A購自中國科學院上海細胞生物研究所。細胞在含10% FBS、5×104U/L青霉素、50 mg/L鏈霉素和2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養液中37 ℃、5% CO2培養。所有實驗均在細胞處于對數生長期時進行。

RAD001 (07741)、氯喹(chloroquine，CQ)及MTT購于Sigma-Aldrich；RAD001 用DMSO 配制成1 mmol/L貯備液。mTOR、p-mTOR、p70S6K和p-p70S6K抗體購自Cell Singnaling；LC3和ULK1抗體購自Novus Biological；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自Santa Cruz； GAPDH 購自上海康成技術有限公司。

2方法

2.1MTT法 取對數生長期的細胞加入96孔板中，每孔7 000～8 000個細胞(195 μL/well)。加入藥物，每組設4個平行孔，置37 ℃培養72 h，實驗中止前4 h加入10 μL MTT液(5 g/L)，再培養4 h，棄去培養液，加入0.1 mL DMSO，待結晶溶解后在酶聯檢測儀上檢測570 nm波長下每孔的A值。按下列公式求出生長抑制率：生長抑制率(%)=(1-用藥組平均A值/對照組平均A值)×100%。用BLISS軟件計算出半數抑制率IC50。

2.2激光共聚焦顯微鏡觀察GFP-LC3 以1.5×108/L的密度,應用無抗體的10%胎牛血清RPMI-1640培養液接種細胞于6孔板中培養，貼壁后以脂質體LipofectamineTM2000轉染GFP-LC3質粒，G418篩選穩定表達GFP-LC3的細胞，加藥處理24 h后，倒去培養液，用PBS洗滌3次，激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、拍照。GFP-LC3質粒購自北京西美杰科技有限公司。

2.3Western blotting檢測 取處于對數生長期的細胞，稀釋成2×108/L，接種于6孔板，每孔2 mL，藥物處理細胞后，收集細胞，PBS洗滌3次，加入細胞裂解液100 μL，14 000 r/min離心10 min，定量蛋白，取40 μg蛋白，加入上樣緩沖液，95 ℃下變性10 min。聚丙烯酰胺SDS凝膠電泳后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉后依次加入Ⅰ抗、Ⅱ抗，在室溫下孵育2 h，TBST緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4，150 mmol/L NaCl，0.1% Tween-20)洗滌3次，每次10 min，加入化學發光劑，放入暗盒中并壓片，2～5 min后顯影、定影。

2.4流式細胞術 (flow cytometry，FCM) 檢測細胞死亡 收集用藥物處理過的細胞，PBS洗滌2次，離心。加入PBS調整細胞密度為1×109/L。取1 mL細胞懸液，加入10 μL 碘化丙啶(propidium iodide,PI; 10 mg/L)染色10 min，避光。立即將標本置于冰塊中，1 h 內用流式細胞儀(Becton Dickinson)檢測。

2.5siRNA干擾實驗 設計靶向ULK1的siRNA序列為5’-GCCCTTTGCGTTATATTGTAT-3’和5’-CCTGGTTATGGAGTACTGCAA-3’。轉染前24 h消化和計數腫瘤細胞，在6孔板中接種細胞，待細胞達到50%～60% 融合時進行轉染。將5 μL siRNA稀釋于100 μL無血清的基礎培養基opti-MEM中，室溫放置5 min；取2 μL LipofectamineTM2000 稀釋于100 μL無血清的基礎培養基opti-MEM中，室溫放置5 min；將稀釋的siRNA溶液加入脂質體溶液中，輕柔混勻，室溫放置20 min；吸棄細胞培養物中的完全培養基，用基礎培養基opti-MEM漂洗細胞2次，加入無血清基礎培養基opti-MEM 0.8 mL；將siRNA-脂質體復合物加入細胞中，前后輕晃6孔板使混合液分散均勻。4～6 h 后吸棄轉染復合物，換入含10%胎牛血清的新鮮培養基。轉染后24 h 進行后續實驗。

3統計學處理

采用SPSS 16.0 軟件分析，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)或t檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1RAD001可抑制人子宮內膜癌Ishikawa細胞及HEC-1A細胞的增殖

以2.5、5、10、20、40和80 nmol/L RAD001處理Ishikawa細胞和HEC-1A細胞72 h，出現明顯的增殖抑制作用，且呈濃度依賴性，其IC50分別為(36.80±1.64) nmol/L和(25.72±1.16) nmol/L，見圖1。上述結果說明RAD001能抑制Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖。

Figure 1. RAD001 suppressed the proliferation of Ishikawa cells (A) and HEC-1A cells (B). The cells were cultured in a 96-well plate (6 000 cells/well), exposed to the indicated concentrations of RAD001 and incubated for 72 h.mean±SD.n=3.

圖1RAD001抑制Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的增殖

2RAD001提高人子宮內膜癌Ishikawa細胞及HEC-1A細胞對紫杉醇的敏感性

RAD001聯合不同濃度的紫杉醇作用于人子宮內膜癌Ishikawa細胞及HEC-1A細胞后，細胞生長受到明顯抑制，其抑制率隨藥物濃度增加逐漸升高，見圖2。在Ishikawa細胞中，單藥紫杉醇的 IC50為(3.91±0.17)μmol/L，兩藥聯用指數為 0.326。在HEC-1A細胞中，單藥紫杉醇的IC50為(6.72±1.14) μmol/L，兩藥聯用指數為0.805。兩種細胞株中藥物聯用指數均小于1，說明兩藥聯合應用對人子宮內膜癌Ishikawa細胞及HEC-1A細胞的生長抑制具有協同作用。

Figure 2. Cell inhibitory rate of taxol and RAD001 alone or together at the indicated concentrations for 72 h. Cells were cultured in a 96-well plate (6 000 cells/well), exposed to the indicated concentrations of taxol and RAD001 (30 nmol/L) for 72 h. The growth inhibition was detected using MTT assay, and the combination index (CI) was determined using CalcuSyn software.Mean±SD.n=3.*P<0.05vstaxol.

圖2RAD001和紫杉醇聯用對Ishikawa細胞及HEC-1A細胞的生長抑制具有協同作用

3RAD001誘導人子宮內膜癌Ishikawa及HEC-1A細胞發生自噬

LC3作為自噬體膜標志性蛋白，定位在自噬體內外膜上。由圖 3A 中可以看出，RAD001 處理可使瞬時轉染 GFP-LC3 質粒的 Ishikawa 及 HEC-1A 細胞胞漿中出現大量綠色熒光點狀聚集，提示自噬體的形成。Western blotting檢測的結果顯示，不同濃度的 RAD001 處理上述細胞 24 h 后，LC3-I 逐漸向LC3-Ⅱ轉化，并呈現明顯的濃度依賴效應，見圖3B。這些結果說明 RAD001 可以誘導 Ishikawa 細胞及 HEC-1A 細胞發生自噬。

Figure 3. RAD001 induced autophagy in Ishikawa cells and HEC-1A cells. A: the cells treated with RAD001 (30 nmol/L) for 24 h, the dots of GFP-LC3 accumulation were observed under confocal microscope; B: the cells were treated with RAD001 at the indicated concentrations for 24 h, and Western blotting was used for detecting LC3-I and LC3-II.

圖3RAD001誘導Ishikawa細胞及HEC-1A細胞發生自噬

4RAD001誘導Ishikawa細胞和HEC-1A細胞發生自噬性細胞死亡

由圖4A中可以看出，當聯用CQ處理細胞后，LC3-II及p62的聚集較分別RAD001單用時明顯增多，表明CQ能夠有效地阻斷自噬，引起自噬溶酶體內蛋白質的不斷堆積。MTT的結果顯示，自噬的抑制使RAD001對Ishikawa細胞和HEC-1A細胞的抑制明顯下調，見圖4B。這提示RAD001誘導人子宮內膜癌Ishikawa細胞和HEC-1A細胞發生自噬性細胞死亡。

Figure 4. Treatment with RAD001 induced autophagic cell death in Ishkawa cells and HEC-1A cells. A: lysates from Ishikawa cells or HEC-1A cells were treated with RAD001 (30 nmol/L) and CQ (10 mg/mL) alone or together, and Western blotting was used to detect the expression of LC3-II and p62; B: the cells were incubated with the indicated concentrations of RAD001 or in combination with 10 mg/mL CQ for 24 h,and the inhibitory rate was detected by MTT assay.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsRAD001.

圖4RAD001誘導Ishikawa細胞和HEC-1A細胞發生自噬性細胞死亡

5RAD001抑制mTOR/p70S6K通路

RAD001能顯著抑制Ishikawa細胞及HEC-1A細胞中mTOR的磷酸化水平，并隨藥物濃度的增加抑制作用越明顯，且mTOR的總量并無改變，見圖5。進一步觀察到mTOR下游重要底物p70S6K的磷酸化水平被明顯抑制，而其總量并無改變，見圖5。這些結果提示RAD001作用于腫瘤細胞Ishikawa及HEC-1A后，可以顯著抑制其mTOR途徑。

6RAD001上調自噬相關蛋白ULK1的表達

ULK1是參與自噬的重要蛋白，在自噬體形成早期發揮重要的作用。Western blotting檢測結果顯示，RAD001能顯著上調Ishikawa細胞及HEC-1A細胞中ULK1蛋白的表達水平，并呈顯著的濃度依賴性，見圖6。

7RAD001通過上調ULK1誘導自噬而產生紫杉醇增敏效應

圖7A顯示，siRNA干擾使ULK1的表達下降70%以上。由圖7B中可以看出，ULK1的表達下調后，RAD001誘導的LC3-I向LC3-II的轉化被顯著地抑制。RAD001分別處理Ishikawa/control和Ishikawa/siULK1細胞，PI染色結果發現，抑制ULK1表達有效阻斷了RAD001誘導的自噬性細胞死亡，見圖7C。RAD001聯合紫杉醇處理可以明顯增加細胞死亡，ULK1表達抑制有效阻斷了這一增敏作用，見圖7D。上述結果提示RAD001通過上調ULK1誘導自噬，增強紫杉醇的抗腫瘤效應。

Figure 5. The effect of RAD001 on mTOR pathway in Ishikawa cells and HEC-1A cells. The cells were treated with RAD001 at the indicated concentrations for 24 h. The cell lysates were analyzed by Western blotting.

圖5RAD001顯著抑制Ishikawa細胞及HEC-1A細胞的mTOR通路

Figure 6. The effect of RAD001 on ULK1 expression in Ishikawa cells and HEC-1A cells. The cells were treated with the indicated concentrations of RAD001 for 24 h, and the expression of ULK1 was examined by Western blotting.

圖6RAD001顯著上調Ishikawa細胞及HEC-1A細胞中ULK1蛋白的表達水平

Figure 7. Silencing ofULK1 blocked RAD001-mediated autophagy and cell death. A: Ishikawa cells were transfected withULK1 siRNA-1 and -2, and the ULK1 protein expression was determined by Western blotting; B: Ishikawa cells were treated with RAD001 (30 nmol/L) in the absence or presence ofULK1 siRNA, and then LC3 protein expression was analyzed; C and D: Ishikawa/control cells and Ishikawa/siULK1 cells were exposed to RAD001 (30 nmol/L) or taxol (4 μmol/L) for 24 h, and the number of dead cells was quantified using PI staining and flow cytometry.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol;△P<0.05vstaxol;#P<0.05vstaxol+RAD001.

圖7RAD001通過上調ULK1誘導自噬而產生紫杉醇增敏作用

討 論

子宮內膜癌目前是婦科三大惡性腫瘤之一，發病率逐年上升，已占到女性生殖系統惡性腫瘤的20%～30%。部分國家已經超過宮頸癌，成為最常見的女性生殖道惡性腫瘤[1]。

mTOR是PI3K/Akt 通路的下游分子，以mTOR 為靶點可抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和逆轉腫瘤細胞對細胞毒藥物的耐藥性。目前，以mTOR為治療靶點已成為腫瘤治療的研究新熱點，mTOR抑制劑RAD001正是其中的代表之一，它作為一種有潛力的腫瘤治療劑已經引起國內外學者的廣泛關注。

紫杉醇是當前子宮內膜癌聯合化療中最常用的藥物之一，但其藥理作用的發揮往往需要很高劑量，從而導致患者較為嚴重的不良反應。在本研究中，作者利用RAD001 聯合紫杉醇處理人子宮內膜癌Ishikawa及HEC-1A細胞，結果顯示RAD001可提高人子宮內膜癌Ishikawa及HEC-1A細胞對紫杉醇的敏感性，從而提示RAD001 與紫杉醇聯合應用不但可以增強紫杉醇的藥理作用，而且可以減少其劑量，從而達到增效減毒的作用。另外RAD001 具有只針對腫瘤細胞、不攻擊正常細胞、對正常機體不良反應小的優點[11]。因此，RAD001 可以作為一種較理想的協同化療藥物，具有廣泛的臨床應用前景。

自噬是一個保守的代謝過程，在饑餓、缺氧、高熱及藥物誘導的情況下發生，能夠降解長周期蛋白、細胞器和胞質。mTOR作為一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，在細胞自噬信號轉導中處于核心地位。作為mTOR的抑制劑，我們的研究證實RAD001可以誘導Ishikawa及HEC-1A細胞發生自噬。自噬是維持細胞內穩態的重要途徑，然而，自噬也被稱為II型程序性細胞死亡。因此，我們在研究抗腫瘤藥物誘導的自噬時，更需謹慎判斷自噬的作用。本研究中，我們進一步應用自噬抑制劑CQ阻斷自噬的發生，結果表明自噬被有效地抑制后，死亡的細胞減少，細胞存活率增高。上述結果證明RAD001誘導的是自噬性細胞死亡。

已有研究證實，在饑餓或雷帕霉素作用條件下，mTOR活性被抑制，Atg13去磷酸化，與Atg1親和力增加，并與Atg17-29-31緊密結合，形成Atg1復合體，在Atg13和Atg17共同作用下，Atg1激活，定位于前自噬體結構(pre-autophagosomal structure,PAS)，從而啟動自噬的發生[12-13]。因此mTOR是自噬的負調控分子，并發揮自噬啟動“門衛”的作用。在本研究中，我們證實RAD001能顯著抑制Ishikawa細胞及HEC-1A細胞中mTOR的磷酸化水平，進而抑制其下游重要底物p70S6K的激活。我們的研究進一步證實RAD001能上調ULK1的表達，抑制ULK1表達有效阻斷了RAD001誘導的自噬性細胞死亡。

綜上所述，在人子宮內膜癌Ishikawa細胞及HEC-1A細胞中，RAD001可以通過抑制mTOR信號通路，上調ULK1的表達，誘導自噬性細胞死亡的發生，從而提高腫瘤細胞對紫杉醇的敏感性。本實驗表明RAD001在子宮內膜癌的治療方面有望成為一種新型的化療增敏劑，進一步豐富了子宮內膜癌的治療模式。

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RAD001promoteschemotherapeuticsensitivityofhumanendometrialcarcinomacellstopaclitaxelviainducingautophagy

WANG Huan, LI Xiao-mao, LIU Sui-ling, LI Tian, DING Jie

(DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:tigerlee777@163.com)

AIM: To explore the effect of mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitor RAD001 on chemotherapeutic sensitivity of endometrial carcinoma cells to paclitaxel.METHODSMTT assay and PI staining were used to assess the cell death. The protein expression of LC3-I, LC3-II, mTOR and ULK1 was detected by Western blotting.ULK1 siRNA was used to abolish the activation of ULK1.RESULTSRAD001 significantly inhibited the growth of human endometrial carcinoma cell lines Ishikawa and HEC-1A. RAD001 enhanced the inhibitory effect of paclitaxel on the growth of Ishikawa cells and HEC-1A cells. RAD001 induced autophagy and autophagic cell death by the inhibition of mTOR/p70S6K pathway and up-regulation of ULK1 expression.CONCLUSIONRAD001 enhances the inhibitory effect of paclitaxel on endometrial carcinoma cell growth by inducing autophagy and autophagic cell death.

RAD001; Ishikawa cells; HEC-1A cells; Autophagy; Paclitaxel

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.009

1000- 4718(2013)11- 1966- 06

2013- 08- 20

2013- 11- 04

廣州市科技計劃資助項目(No. 2012KP072)

△通訊作者 Tel: 020-85253040； E-mail: tigerlee777@163.com