PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡*

費洪榮， 趙 瑩， 王桂玲， 曲曉蘭， 王鳳澤

(泰山醫學院 1藥學院， 2生物科學學院， 3醫藥生物技術研究所，山東 泰安 271016)

PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502誘導人胃癌SGC-7901細胞凋亡*

費洪榮1， 趙 瑩1， 王桂玲1， 曲曉蘭1， 王鳳澤2,3△

(泰山醫學院1藥學院，2生物科學學院，3醫藥生物技術研究所，山東 泰安 271016)

目的檢測PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對人胃癌SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響及可能的分子機制。方法MTT法檢測細胞活力；流式細胞術分析細胞周期變化；Annexin V-FITC/PI雙標法測定細胞凋亡；免疫印跡分析細胞內蛋白表達的變化。結果PF-04691502處理SGC-7901細胞后，降低細胞的活力并促進細胞阻滯于G1期，同時抑制cyclin D1的表達并上調p21的蛋白水平。PF-04691502可明顯誘導SGC-7901細胞凋亡，其機制與其促進caspase家族成員的活化并切割聚(腺苷二磷酸核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP] 底物密切相關。結論PI3K/mTOR 雙重抑制劑PF-04691502能夠通過阻滯細胞周期來抑制SGC-7901細胞的增殖，同時能夠激活細胞內caspase，使PARP發生剪切而誘導細胞凋亡。

PF-04691502； PI3K/mTOR； 細胞增殖； 細胞凋亡； 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶類

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B/mammalian target of rapamycin, PI3K/Akt/mTOR)信號途徑作為真核細胞內重要信號轉導通路之一，與腫瘤的發生發展密切相關[1-2]。 PI3K是一個脂激酶家族，參與調控細胞的增殖、凋亡和分化等生命過程；mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其羧基末端與PI3K催化區高度同源，是PI3K信號通路的一個關鍵調節位點[3]。研究發現，多種實體瘤的發生與PI3K/Akt/mTOR信號通路的突變或過度活化密切相關，因此抑制該信號途徑已成為臨床上腫瘤治療的有效手段，篩選PI3K/Akt/mTOR抑制劑并研究其抑癌活性則具有重要的理論意義與治療價值[4-5]。本研究以人胃癌SGC-7901細胞為實驗材料，檢測PI3K和mTOR的雙重靶向抑制劑PF-04691502對SGC-7901細胞增殖和凋亡的影響，從而為胃癌臨床用藥提供理論指導與實驗依據。

材 料 和 方 法

1細胞培養

人胃癌細胞株SGC-7901購自南京凱基生物有限公司，于37 ℃和5% CO2條件下用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養。

2試劑

PF-04691502 購自 Selleck Chemicals；RPMI-1640 培養基和胎牛血清購自 Gibco；MTT購自Genview；propidium iodide (PI)購自Sigma-Aldrich；Annexin V-FITC 購自南京凱基生物有限公司；caspase-3抗體、caspase-8抗體、caspase-9抗體和多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]抗體購自Cell Signaling Technology；β-actin抗體購自Sigma；cyclin D1抗體和p21抗體購自Santa Cruz；Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物公司。

3MTT檢測細胞活力

SGC-7901細胞接種于96孔板中，用不同劑量的PF-04691502 處理后繼續培養24 h，對照組加入DMSO；終止培養前4 h加20 μL(5 g/L)的MTT。吸去培養基后加入150 μL DMSO，室溫振蕩5～10 min；490 nm波長下測定各孔的吸光度，以同樣的方法測6個平行孔的吸光度讀數并計算平均值。

4流式細胞術檢測細胞周期與凋亡

PF-04691502處理SGC-7901細胞24 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液；用75%冷無水乙醇4 ℃固定過夜后加入50 mg/L RNase A，37 ℃ 孵育30 min，加50 mg/L PI閉光染色 15 min，接著上機檢測并分析細胞的周期分布。細胞凋亡檢測操作參照試劑盒說明書進行，根據Annexin V和PI的熒光強度計算凋亡百分率。實驗重復3次。

5免疫印跡實驗

RIPA細胞裂解液冰上裂解細胞20 min，4 ℃ 13 000×g離心20 min后收集上清并定量分析。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE分離蛋白，然后電轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉后加入Ⅰ抗；室溫孵育3 h后加入Ⅱ抗孵育1 h后暗室曝光顯影。

6統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD) 表示，均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1PF-04691502抑制SGC-7901細胞的增殖

SGC-7901細胞經不同劑量的PF-04691502處理24 h后，MTT法檢測細胞活力，結果見圖1，PF-04691502抑制了SGC-7901細胞的活力。

Figure 1. PF-04691502 reduced the viability of SGC-7901 cells. Cells were incubated with PF-04691502 at the indicated concentrations for 24 h and then processed for MTT assay. Mean±SD.n=6.

圖1MTT法檢測PF-04691502對SCC-7901細胞活力的抑制作用

2PF-04691502阻滯SGC-7901細胞于G1期

采用流式細胞術檢測了PF-04691502對SGC-7901細胞周期的影響，發現PF-04691502作用于SGC-7901細胞后，細胞明顯阻滯于G1期，而處于S期的細胞數目則明顯減少，見圖2。

Figure 2. PF-04691502 treatment resulted in cell cycle arrest at G1stage. SGC-7901 cells were exposed to different concentrations of PF-04691502 for 24 h. The cell cycle analysis was determined by PI staining and flow cytometry. Mean±SD.n=3.

圖2PF-04691502作用SGC-7901細胞24h后，流式細胞術分析細胞周期的變化

免疫印跡結果表明，PF-04691502誘導細胞G1期阻滯與其抑制cyclin D1的蛋白水平，并上調p21的表達密切相關，見圖3。

Figure 3. PF-04691502 down-regulated cyclin D1 expression and up-regulated p21 expression in SGC-7901 cells. Cells were cultured for 24 h in the presence of increasing doses of PF-04691502. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μ mol/L.

圖3PF-04691502對SGC-7901細胞中cyclinD1及p21表達的影響

3PF-04691502對SGC-7901細胞凋亡的影響

SGC-7901細胞經PF-04691502處理后，細胞發生明顯的凋亡，見圖4。

免疫印跡結果顯示，SGC-7901細胞經PF-04691502作用24 h后，caspase-3、caspase-8、caspase-9和PARP出現明顯的活性切割，見圖5。

討 論

近年的研究發現，PI3K/Akt信號途徑參與腫瘤細胞的增殖、存活、分化及血管生成等生命過程，設計篩選該信號通路的特異性抑制劑對癌癥的臨床治療具有非常重要的實際意義[6-7]。本研究檢測PI3K/mTOR雙重抑制劑PF-04691502對SGC-7901細胞增殖及凋亡的影響，發現PF-04691502抑制了胃癌細胞的生存力，且抑制作用呈劑量依賴性(圖1)。流式結果表明PF-04691502誘導SGC-7901細胞阻滯于G1期，其機制與PF-04691502抑制SGC-7901細胞中cyclin D1的蛋白水平，增加了p21的表達相關。

化合物的抗癌活性與腫瘤細胞的凋亡關系密切[8]。本研究檢測了PF-04691502對SGC-7901細胞凋亡的影響，發現PF-04691502可誘導胃癌細胞發生明顯的凋亡現象。細胞凋亡的執行可以通過內源性和外源性2條途徑執行。在內源性的凋亡途徑中，細胞色素C 與凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)促使pro-caspase-9 與兩者結合形成凋亡小體同時活化caspase-9；激活的caspase-9 又活化caspase-3，將PARP切割成小片段，使PARP的活性喪失[9-10]。在本研究中，胃癌細胞SGC-7901 經PF-04691502作用24 h后，促進procaspase-9 和procaspase-3剪接成有活性的caspase-9 和caspase-3。在外源性細胞凋亡信號通路中，細胞通過激活的死亡受體招募接頭蛋白Fas相關死亡結構域蛋白(FADD)，FADD進而募集并激活caspase-8從而啟動細胞凋亡。本實驗結果表明，caspase-8的切割產物隨著PF-04691502濃度的增加而增多(圖5) 。

Figure 4. PF-04691502 induced apoptosis of SGC-7901 cells. Cells were incubated with the indicated concentrations of PF-04691502 for 24 h, and the apoptosis was determined by Annexin V/PI staining analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L.

圖4AnnexinV/PI檢測PF-04691502對SGC-7901胃癌細胞凋亡的影響

Figure 5. PF-04691502 treatment activated the cleavage of caspase-3, caspase-8, caspase-9 and PARP in SGC-7901 cells．CF:cleaved fragment.

圖5PF-04691502對caspases家族主要蛋白因子和PARP活性切割的影響

總之，PF-04691502能夠抑制SGC-7901胃癌細胞的增殖，阻滯細胞于G1期；PF-04691502可通過激活caspases的活性切割而誘導SGC-7901細胞發生凋亡現象。本研究為PF-04691502用于胃癌的臨床治療提供了理論基礎與實驗依據。

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PI3K/mTORdualinhibitorPF-04691502inducesapoptosisofhumangastriccancerSGC-7901cells

FEI Hong-rong1, ZHAO Ying1, WANG Gui-ling1, QU Xiao-lan1, WANG Feng-ze2,3

(1SchoolofPharmacy,2SchoolofBiologicalSciences,3InstituteofMedicinalBiotechnology,TaishanMedicalUniversity,Taian271016,China.E-mail:wfz221@sina.com.cn)

AIM: To determine the antitumor effect of PF-04691502, a dual inhibitor of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt and mammalian target of rapamycin (mTOR), on the viability and apoptosis of human gastric cancer cell line SGC-7901.METHODSCell viability was analyzed by MTT assay. Cell cycle was detected by flow cytometry, and Annexin V-FITC/PI dual staining was used to detect cell apoptosis. Protein expression of p21, cyclin D1, caspase-3, caspase-8, caspase-9 and poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) was determined by Western blotting.RESULTSMTT assay and cell cycle analysis results indicated that PF-04691502 inhibited the viability of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner, and arrested the cells in G1phase. PF-04691502 down-regulated the expression of cyclin D1 and up-regulated the expression of p21. In addition, SGC-7901 cells treated with PF-04691502 showed typical characteristics of apoptosis, accompanied by activation of caspases and cleavage of PARP.CONCLUSIONThe PI3K/mTOR dual inhibitor PF-04691502 induces the apoptosis and inhibited the growth of SGC-7901 cells, implicating its potential therapeutic value for the treatment of cancer.

PF-04691502; PI3K/mTOR; Cell proliferation; Apoptosis; Caspases

R966

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.11.008

1000- 4718(2013)11- 1962- 04

2013- 06- 04

2013- 07- 15

國家自然科學基金資助項目(No. 81272683)； 山東省自然科學基金資助項目(No. ZR2011HQ034)

△通訊作者 Tel: 0538-6236075； E-mail:wfz221@sina.com.cn