IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用*

趙京霞， 底婷婷， 王 燕， 劉 欣， 梁代英， 李 萍△

(1北京中醫藥大學基礎醫學院, 北京 100029; 2北京市中醫研究所, 首都醫科大學附屬北京中醫醫院, 北京 100010)

IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用*

趙京霞1,2， 底婷婷2， 王 燕2， 劉 欣2， 梁代英2， 李 萍1,2△

(1北京中醫藥大學基礎醫學院, 北京 100029;2北京市中醫研究所, 首都醫科大學附屬北京中醫醫院, 北京 100010)

目的觀察IL-23/IL-17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損形成過程中的作用及變化規律。方法雌性BALB/c小鼠隨機分為正常對照組和咪喹莫特組，采用PASI評分觀察銀屑病樣小鼠模型皮損動態變化；光鏡觀察皮損組織形態學變化；細胞因子抗體芯片技術對比檢測兩組小鼠血清及皮損組織中細胞因子譜的變化；采用流式細胞小球微陣列術、實時熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析技術對小鼠血清及皮膚組織中細胞因子含量、mRNA和蛋白表達水平進行檢測；流式細胞術分析外周血及脾細胞成分。結果咪喹莫特誘導小鼠產生紅斑、鱗屑、增厚等典型的銀屑病樣皮損，并隨著給藥時間的延長呈現一個拋物線型的動態變化；經咪喹莫特外用刺激后，小鼠皮膚及血清中IL-23/IL-17軸相關細胞因子、Th1、Th2和Treg類細胞因子含量及表達水平均顯著升高。IL-23/IL-17軸細胞因子表達也呈現一個先升高后降低的動態變化過程。咪喹莫特組小鼠外周血及脾細胞中樹突狀細胞比例顯著升高，脾細胞中Th17細胞比例升高，約為正常對照組的3～4倍，Treg細胞比例約為正常對照組的2倍。結論咪喹莫特誘導小鼠產生的皮損癥狀、病理學特征及細胞因子改變都與銀屑病相似，是進行銀屑病研究可行的動物模型，該模型制備后第1～8天可模擬疾病的發展階段。Th17細胞活化及IL-23/IL-17軸參與了該模型皮損的形成，并呈現一個先升高后降低的動態變化過程。Th1細胞介導的炎癥反應也參與了該模型皮損的形成，并且伴隨Treg 和Th2類細胞因子的反饋性升高。

銀屑??； 咪喹莫特； 白細胞介素23/白細胞介素17軸； Th17

銀屑病是一種常見的以鱗屑性紅斑為特點的慢性炎性皮膚病，目前已被定義為器官特異性的自身免疫性疾病[1]，白細胞介素(interleukin，IL)-23/IL-17炎癥軸在銀屑病的發病過程中起著重要的作用[2]。樹突狀細胞分泌的IL-23 分子與受體結合后可誘導Th17細胞增殖、活化并分泌IL-17、IL-22等多種細胞因子[3]，這些細胞因子募集中性粒細胞[4]，誘發銀屑病等多種炎性損傷，這被稱為IL-23/IL-17炎性軸。

咪喹莫特(imiquimod，IMQ)是Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)7/8的激動劑，主要用于外陰及肛周疣和光化性角化病的局部治療。臨床應用時發現，該藥物可加重銀屑病患者的癥狀或誘導銀屑病的復發[5]。進一步研究發現將咪喹莫特外涂于小鼠皮膚，可誘導小鼠皮膚出現銀屑病樣皮損及組織學改變，與人類銀屑病病理變化有很多相似之處[6]。我們的前期研究也證實了這個結果[7]。van der Fits等[8]報道，咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損改變伴隨著IL-23/IL-17軸的變化，但其具體的變化規律未見報道，是否其它T細胞(Th1、Th2和Treg)介導的免疫應答也參了此模型皮損的形成過程，目前仍不清楚。本實驗擬在此基礎上，觀察IL-23/IL-17炎癥軸在該模型中的變化規律，對其作為銀屑病藥物篩選及機制研究的動物模型前景進行探索。

材 料 和 方 法

1動物

雌性BALB/c小鼠[由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)20090007]，體重18～20 g，飼養于SPF級動物室。

2試劑和藥物

咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業有限責任公司)；凡士林(河北蘭煉飛天石化有限公司)；CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC和CD11c-PE單克隆抗體(Biole-gend)；佛波醇-12-肉豆蒄酯-13-乙酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)和ionomycin(Sigma)； IL-17-PE抗體、IFN-γ-APC抗體、IL-4-APC抗體、Foxp3-PE抗體、CD4-FITC抗體和CD25-APC抗體(eBioscience)；小鼠細胞因子抗體芯片試劑盒(RayBio)；小鼠Th17/Th2/Th1 流式細胞小球微陣列術(cytometric bead array,CBA)定量檢測試劑盒(BD)；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒和UltraSYBR Mixture(CWbio)；IL-23兔多克隆抗體和IL-17兔多克隆抗體(Abcam)。

3方法及分組

BALB/c小鼠戊巴比妥鈉80 mg/kg腹腔注射麻醉，刮除其背部毛發，形成約2 cm×3 cm大小的暴露區域，單籠飼養。隨機分為正常對照組(control，CTRL)和IMQ組。IMQ組小鼠每天涂抹5%IMQ乳膏42 mg，正常對照組小鼠背部每日涂抹等量凡士林，連續14 d，分別于2、4、6、8、10、12和14 d取材。

4檢測指標與方法

4.1小鼠銀屑病樣皮損面積和疾病嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分 采用數碼照相的方法每天記錄，并依據PASI評分標準，給予小鼠皮損處紅斑(erythema)、鱗屑(scales)及浸潤增厚程度(thickness) 0～4的積分，將三者積分相加得到總積分。PAIS評分標準如下：0，無；1，輕度；2，中度；3，重度；4，極重度。對各組小鼠積分取平均值后繪制趨勢線，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

4.2小鼠皮損病理學檢測 采用HE染色觀察。每組4只小鼠脫頸處死后，按照九格法各組剪取相對應皮損處組織,固定于10%甲醛中，經脫水、石蠟包埋、切片、HE染色,每個標本選4張染色切片進行觀察并照相。

4.3小鼠皮損及血清細胞因子芯片檢測 小鼠血清及組織中細胞因子的定性檢測采用Raybiotech公司細胞因子抗體芯片進行測定，該芯片可同時測定20余種細胞因子。具體操作嚴格按試劑盒的說明書進行，X射線膠片曝光后，將膠片上的圖像用掃描儀掃描并轉換為灰度TIFF格式的圖片文件保存。運行ScanAlyze軟件，將灰度TIFF格式圖片的點陣轉化為數字型數據，將此原始數據儲存為Microsoft Excel文件。

4.4小鼠血清細胞因子定量檢測 采用CBA定量檢測小鼠血清細胞因子的濃度。測定方法如下：按試劑盒要求將標準品稀釋成不同濃度，在待測管中加入不同細胞因子抗體的混合微珠，然后加入不同濃度標準品或待測血清樣本，再分別加入PE標記的檢測抗體，充分搖勻后室溫避光孵育3 h后，上機檢測。

4.5小鼠外周血細胞CD4+T細胞、CD8+T 細胞、CD11c+細胞數量檢測 取小鼠抗凝血0.1 mL×2管，分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC單克隆抗體、混合液和CD11c-PE單克隆抗體，避光放置30 min。加入Lysis Buffer裂解紅細胞后離心洗滌，PBS重懸，進行流式細胞術檢測。

4.6小鼠脾臟變化觀察 小鼠稱重后處死，取脾臟稱重，計算脾指數(脾指數=脾重量/體重)，反映動態小鼠全身反應改變。

4.7小鼠脾臟免疫細胞成分檢測 (1)常規分離各組小鼠脾細胞，獲得脾細胞懸液。分別加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC單克隆抗體混合液和CD11c-PE單克隆抗體，避光30 min后，離心洗滌重懸，進行流式細胞術檢測分析CD4+T細胞、CD8+T 細胞和CD11c+細胞比例變化。(2)調整脾細胞懸液濃度，加入PMA及ionomycin培養1 h后，再加入蛋白轉運抑制劑Brefeldin A繼續培養4 h。分別加入anti-mouse CD4-FITC抗體或CD4-FITC抗體與CD25-PE抗體的混合液，室溫避光30 min，PBS洗滌重懸，細胞經固定、破膜后，進行胞內細胞因子檢測。分別加入PE標記的anti-mouse IL-17抗體、APC標記的anti-mouse IFN-γ抗體、APC標記的anti-mouse IL-4抗體和PE標記的anti-mouse Foxp3抗體，避光30 min，PBS洗滌后重懸細胞，流式細胞儀檢測分析Th17細胞(CD4+IL-17+)、Th1細胞(CD4+IFN-γ+)、Th2細胞(CD4+IL-4+)和Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞比例變化。

4.8實時熒光定量PCR檢測 用超純RNA提取試劑盒提取組織樣本中總RNA。用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄，實驗操作按產品說明書進行。采用實時熒光定量PCR儀(ABI 7300)進行擴增，引物序列如下：IL-23 上游引物5’-GACTCAGCCAACTCCTCCAGCCAG-3’，下游引物5’-TTGGCACTAAGGGCTCAGTCAGA-3’；IL-17A 上游引物5’-CAGACTACCTCAACCGTTCCA-3’，下游引物5’-ACAATCGAGGCCACGCAGGTGCAGC-3’；IL-17F 上游引物5’-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3’，下游引物5’-AATGCCCTGGTTTTGGTTGAA-3’；IL-22 上游引物5’-CGTCAACCGCACCTTTAT-3’，下游引物5’-AGGGCTGGAACCTGTCTG-3’；TNF-α 上游引物5’-GAGAAGTTCCCAAATGGC-3’，下游引物5’-ACTTGGTGGTTTGCTACG-3’；IFN-γ 上游引物5’-TAACTCAAGTGGCATAGATGTGGAAG-3’，下游引物5’-GACGCTTATGTTGTTGCTGATGG-3’；IL-10 上游引物5’-CTGGACAACATACTGCTAACCGACTC-3’，下游引物5’-AACTGGATCATTTCCGATAAGGC-3’；IL-4上游引物5’-TCGTCTGTAGGGCTTCCAAGGTGCT-3’，下游引物5’-GTGGACTTGGACTCATTCATGGTGC-3’；用熒光染料UltraSYBR Mixture嵌合熒光法進行PCR擴增。擴增程序為：95 ℃ 10 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s)×50個循環。采用2-ΔΔCt法進行數據的相對定量分析。

4.9蛋白質提取及Western blotting分析 常規提取皮損組織蛋白，BCA蛋白定量試劑盒對提取的細胞總蛋白進行蛋白定量。各組取20 μg樣品蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉移到PVDF膜上，封閉液室溫封閉1 h。加入特異性識別抗體，4 ℃封閉過夜。TBS振蕩洗膜后，加入熒光Ⅱ抗(1∶10 000)，避光孵育1 h，Odssey雙色紅外成像儀掃描分析。

5統計學處理

數據以均數±標準差(mean±SD)表示。使用SPSS 15.0軟件對數據進行分析，兩組間均數比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1IMQ誘導的小鼠銀屑病樣動物模型皮損的形態學變化

圖1可見，正常對照組小鼠皮膚較薄，無鱗屑，無增厚改變。IMQ組小鼠在IMQ涂抹1 d后皮膚即出現點狀紅斑，2～3 d后出現細小鱗屑，皮膚褶皺。隨著時間的延長，IMQ組小鼠皮損日益嚴重：紅斑由少量淡粉色變為大面積深紅色；鱗屑增多增厚，由少量細屑過渡至布滿全暴露皮膚的層狀鱗屑，易脫落，脫落后可見點狀出血；皮膚增厚明顯，逐漸隆起、皺折，幾乎占暴露皮膚的2/3以上。皮損在涂藥后7和8 d癥狀最為嚴重，此后紅斑緩緩消退，鱗屑快速脫落，僅殘留部分細小碎屑，但顏色依然偏紅，增厚情況減退緩慢。直到14 d后，紅斑及鱗屑都已消退，增厚緩解不明顯。依據PASI評分標準繪制趨勢線可觀察到，皮損變化過程與趨勢線相似：正常對照組小鼠紅斑、鱗屑及增厚程度趨勢線始終平穩在0左右；IMQ組小鼠紅斑積分持續增加，至8 d左右可達高峰，此后積分較快降低，至13 d后可達平穩，降低減緩，但仍高于正常值；IMQ組鱗屑積分前期增加迅速，5～6 d后達到平穩，9 d后逐漸減低；IMQ組增厚趨勢前期呈現穩步上升局勢，到8 d左右達頂峰，此后，較緩慢降低，但始終明顯高于正常,見圖2。

Figure 1. The gross observation of mouse lesional skin induced by IMQ. BALB/c mice were treated with IMQ or vehicle (control,CTRL) once a day for 14 d, and the morphology of skin was examined at different time points.

圖1IMQ誘導的小鼠背部皮損的大體觀察

Figure 2. The PASI scores of mouse lesional skin induced by IMQ.Erythema, scales, and thickness of the back skin were scored daily on a scale from 0 to 4，and the cumulative score (erythema+scales+thickness) was calculated. Mean±SD.n=6.

圖2IMQ誘導的小鼠背部皮損PASI積分的變化

2IMQ誘導的銀屑病樣動物模型皮損的組織學變化

HE染色顯示，正常對照組小鼠皮膚表皮層菲薄，僅2～3層，細胞形態正常。與正常對照組比較，IMQ組小鼠皮膚表皮層2 d即有明顯增厚，出現角化不全，棘細胞數量增加。隨著時間的延長，表皮層逐漸增厚，伴隨Munro微膿腫的出現，內有炎癥細胞及表皮細胞碎片，角化不全嚴重，角質層內殘留有固縮的細胞核，真皮炎癥細胞浸潤明顯，血管增生、擴張尤其在真皮淺層。炎癥反應至8 d為頂峰，此后表皮厚度降低，角化不全減少，炎癥細胞浸潤及血管增生擴張減輕，但14 d時仍高于正常，見圖3。

Figure 3. The histological changes of mouse lesional skin induced by IMQ (HE staining).

圖3IMQ誘導的小鼠皮損的組織學改變

3IMQ誘導的銀屑病樣皮損動物模型血清細胞因子譜的變化

細胞因子抗體芯片掃描結果顯示，與正常對照組比較，IMQ組小鼠第6天的血清中升高的細胞因子主要有：粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)、IL-9、IL-10和IL-17。其中升高大于2倍的因子有GM-CSF、IFN-γ和IL-17，其中IL-17的升高尤為顯著，見圖4和表1。CBA定量檢測結果顯示，與正常小鼠對比，IMQ組小鼠血清中IL-17、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、IFN-γ、IL-4和IL-10濃度均顯著升高(P<0.01或P<0.05)，見表2。

Figure 4. The cytokine scanning of the serum from IMQ-treated mice determined by cytokine protein array.

圖4IMQ誘導的小鼠血清中細胞因子的掃描結果

表1IMQ組小鼠血清與正常對照組相比上調≥1.3倍的細胞因子列表

Table 1. The serum cytokines whose indexes were more than or equal to 1.3 times of IMQ/CTRL

RowCoulumnNameIMQ/CTRL5,6JMIG1.30124353,4IIL-91.33345443,4JIL-101.45528401,2IEotaxin-21.36246055,6CI-TAC1.97677883,4BIFN-γ2.51877803,4AGM-CSF3.64661445,6BIL-178.0360088

表2IMQ誘導的小鼠血清中細胞因子濃度的變化

Table 2. The serum concentrations of the cytokines in IMQ-treated mice (ng/L.Mean±SD.n=6)

GroupIL-17TNF-αIFN-γIL-4IL-10CTRL2.62±0.396.67±1.593.90±0.923.12±0.514.71±0.52IMQ5.85±0.41**30.74±5.18**30.54±11.20*6.08±0.60**46.97±3.92**

*P<0.05，**P<0.01vsCTRL.

4IMQ誘導的銀屑病樣皮損動物模型皮損細胞因子譜的變化

與正常小鼠對比，IMQ組小鼠第6天的皮膚組織中升高的細胞因子主要有：角質形成細胞源性趨化因子(keratinocyte-derived chemokine,KC;又稱CXCL1)、粒細胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、GM-CSF、IL-10、IL-12 p40/p70和IL-17,見圖5和表3。Western blotting結果顯示，IMQ組小鼠皮損組織中IL-17和IL-23表達較正常對照小鼠顯著升高，見圖6和表4。

Figure 5. The cytokine scanning of the lesional skin from IMQ-treated mice determined by cytokine protein array.

圖5IMQ誘導的小鼠皮損組織中細胞因子的掃描結果

5IMQ誘導的銀屑病樣皮損動物模型皮損細胞因子mRNA的異常表達

與正常小鼠對比，IMQ組小鼠第4天的皮損組織中除了Th1類細胞因子(IFN-γ)、IL-23及Th17類細胞因子(IL-17A、IL-17F、IL-22)mRNA水平顯著升高外，Th2類細胞因子IL-4及Treg細胞因子IL-10 mRNA水平也顯著升高，見圖7。

表3IMQ誘導的小鼠皮損組織上調≥1.3倍的細胞因子列表

Table 3. The lesional skin cytokines whose indexes were more than or equal to 1.3 times of IMQ/CTRL

RowCoulumn NameIMQ/CTRL3,4JIL-101.45028861,2LG-CSF1.57976745,6BIL-171.71369513,4AGM-CSF1.71494573,4KIL-12p40/p701.74273467,8ARANTES1.97397951,2HEotaxin1.97764027,8DTECK2.09608645,6DKC3.3651635

Figure 6. IL-17 and IL-23 protein expression in lesional skin of mice induced by IMQ.

圖6IMQ誘導小鼠皮損組織中IL-17和IL-23蛋白的表達

表4IMQ誘導的小鼠皮損組織IL-17和IL-23蛋白的相對表達量

Table 4. The relative protein expression of IL-17 and IL-23 in mice lesional skin induced by IMQ(Mean±SD.n=6)

GroupIL-23/GAPDHIL-17/GAPDHCTRL0.21±0.030.28±0.03IMQ0.59±0.08**0.55±0.07**

**P<0.01vsCTRL.

6IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損中IL-23/IL-17軸相關細胞因子mRNA表達的變化規律

收集IMQ組小鼠0、2、4、6和8 d的皮損組織，采用實時熒光定量PCR的方法檢測皮損組織中IL-23/IL-17軸相關細胞因子mRNA表達的變化，結果顯示，IL-23和IL-17A mRNA水平在IMQ給藥后5～6 d達到高峰，隨后開始下降，IL-17A mRNA水平下降幅度明顯。TNF-α和IL-17F mRNA水平在第3～4 d達到高峰后開始下降。IMQ誘導后，小鼠皮損中IL-23/IL-17軸相關細胞因子mRNA表達水平呈現先升高后降低的動態變化規律,見圖8。

Figure 7. The mRNA expression of the cytokines in lesional skin from IMQ-treated mice determined by real-time PCR.Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

圖7IMQ誘導的小鼠皮損組織中細胞因子mRNA的表達

7IMQ誘導的銀屑病樣皮損小鼠外周血細胞成分的變化

流式細胞術結果顯示，與正常對照組小鼠相比，IMQ作用于小鼠皮膚8 d后，小鼠外周血中CD11c+樹突狀細胞比例顯著增高(P<0.01)，CD4+T細胞與CD8+T細胞比例相對下降，見表5。

8IMQ誘導的銀屑病樣皮損小鼠脾重及細胞成分的變化

IMQ作用于刺激小鼠皮膚8 d后，IMQ組小鼠脾重約為正常對照組2倍，脾指數也明顯高于正常對照組(P<0.01)，見表6。對脾細胞成分進行流式細胞術檢測發現，與正常對照組小鼠相比，IMQ組小鼠脾細胞中CD11c+樹突狀細胞比例顯著增高(P<0.01)，CD4+T細胞與CD8+T細胞比例相對下降，見表7。為進一步檢測CD4+T細胞中Th1(CD4+IFN-γ+)細胞、Th17(CD4+IL-17+)細胞及Treg(CD4+CD25+Foxp3+)細胞的比例，各組脾細胞經PMA 和 ionomycin刺激5 h后，流式細胞術檢測顯示IMQ組小鼠脾細胞中Th17細胞比例較正常對照組顯著升高(P<0.05)，約為正常對照小鼠的3～4倍；Th1和Th2細胞比例與正常對照組相比沒有明顯的變化。IMQ組脾細胞中Treg細胞比例也顯著升高(P<0.01)，約為正常對照小鼠的2倍，見表8。

Figure 8. The cytokine mRNA dynamic expression in lesional skin from IMQ-treated mice determined by real-time PCR.Mean±SD.n=4.

圖8IMQ誘導的小鼠皮損組織中細胞因子mRNA表達的動態變化

表5IMQ誘導的小鼠外周血中CD4+T、CD8+T和CD11c+細胞比例的變化

Table 5. The proportion of CD4+T, CD8+T and CD11c+cells in peripheral blood of mice induced by IMQ (%.Mean±SD.n=5)

GroupCD11c+CD3+CD4+CD3+CD8+CTRL1.27±0.4225.94±4.817.58±1.92IMQ6.76±1.23**20.71±3.62*5.44±1.04

*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

表6IMQ誘導的小鼠脾重及脾指數的變化

Table 6. The spleen mass and index changes of mice induced by IMQ(Mean±SD.n=6)

GroupSpleenmass(g)Spleenindex(mg/g)CTRL0.080±0.0104.51±0.37IMQ1.721±0.033**10.20±2.03**

*P<0.05,**P<0.01vsCTRL.

表7IMQ誘導的小鼠脾臟中CD4+T、CD8+T和CD11c+細胞比例的變化

Table 7. The proportion of CD4+T,CD8+T and CD11c+cells in spleen of mice induced by IMQ(%.Mean±SD.n=5)

GroupCD11c+CD3+CD4+CD3+CD8+CTRL9.89±3.0018.15±4.0811.06±2.28IMQ24.44±4.94**8.24±1.92**4.17±1.19**

*P<0.05，**P<0.01vsCTRL.

表8IMQ誘導的小鼠脾臟中CD4+IL-17+、CD4+IFN-γ+、CD4+IL-4+和CD4+CD25+Foxp3+細胞比例的變化

Table 8. The proprtion of CD4+IL-17+, CD4+IFN-γ+, CD4+IL-4+and CD4+CD25+Foxp3+cells in spleen of mice induced by IMQ (%. Mean±SD.n=5)

GroupCD4+IL-17+CD4+IFN-γ+CD4+IL-4+CD4+CD25+Foxp3+CTRL0.52±0.154.50±1.390.67±0.3811.51±0.51IMQ2.12±0.63**3.65±1.040.63±0.2621.68±0.79**

**P<0.01vsCTRL.

討 論

目前針對IMQ誘導小鼠銀屑病樣皮損的研究多集中在給藥后第5～8天的觀察[9-10]。我們的研究對此模型進行了0～14 d的觀察，發現IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損隨著時間的延長呈現一個拋物線型的動態變化：在IMQ涂抹1～3 d后小鼠皮膚即出現紅斑、細小鱗屑和褶皺。第7～8 d銀屑病樣癥狀最為嚴重，此后隨著IMQ給藥時間的延長，紅斑不再繼續加重且有消退的趨勢，鱗屑脫落，但皮膚增厚依然嚴重。從小鼠銀屑病樣皮損PASI評分趨勢圖上可以明顯看出這一動態變化過程。IMQ作用后小鼠皮損組織病理學動態改變也與皮損形態變化一致，典型的銀屑病樣病理學改變均在第8天表現最為明顯，然后逐漸改善。同時，我們觀察了第8天IMQ停止給藥后小鼠皮損的變化，PASI評分及病理學表現也出現了上述同樣的下降規律[11]，但下降幅度明顯大于IMQ連續給藥組。

根據以上結果推測，IMQ外用誘導的是一個暫時的炎癥爆發，該模型在IMQ持續作用下可能發生藥物適應、耐受情況，致使皮損出現自限性傾向，類似銀屑病臨床急性期的自愈現象。因此，IMQ誘導的小鼠銀屑病樣動物模型有時間窗的限制，可以認為前8 d為疾病的發生、發展階段，可應用于銀屑病發病機制探索、藥物篩選及干預作用機制研究。

在實驗中，我們發現隨著IMQ給藥時間的延長，小鼠出現精神萎靡、食欲降低、體重下降等全身反應癥狀，并且脾臟顯著增大，第8天時，脾重約為正常對照組2倍，脾指數也明顯高于正常對照組，提示IMQ局部外用刺激可引起小鼠免疫系統的亢進、紊亂等全身反應。這也解釋了為何臨床應用IMQ局部治療會導致患者出現流感樣癥狀及誘發銀屑病等副作用。

為深入了解參與IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損形成的細胞免疫應答類型，我們采用細胞因子抗體芯片檢測技術對該模型小鼠血清及皮損組織中24種細胞因子進行了篩選和分析。經IMQ刺激后，小鼠皮膚及血清中Th1類細胞因子如IFN-γ、Th17類細胞因子如IL-17和粒細胞類的集落刺激因子(GM-CSF)等及Treg類細胞因子(IL-10)均顯著升高，提示Th1、Th17和Treg細胞介導的免疫反應參與了該模型皮損的形成。

由于細胞因子抗體芯片是一種定性的分析工具，只能反映樣本之間相關細胞因子相對表達豐度的高低，為進一步明確各組小鼠皮膚及血清中細胞因子譜的變化，我們分別采用CBA、實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡等定量及半定量分析技術對小鼠血清中細胞因子的含量及皮膚組織中細胞因子mRNA、蛋白表達水平進行了檢測。與細胞因子抗體芯片檢測結果一致，無論在IMQ誘導的小鼠模型血清還是皮損組織中，Th17類細胞因子(IL-17、IL-22)、Th1類細胞因子(IFN-γ)和Treg類細胞因子(IL-10)的表達均顯著高于正常小鼠。此外，Th2類細胞因子IL-4的表達在此模型中也顯著升高，這與細胞因子抗體芯片檢測結果是不同的，可能與不同檢測方法間的差異及靈敏度有關。以上結果明確了Th17類細胞因子在此模型中的作用，這與van der Fits等[8]的報道一致。并且我們發現另外一類具有促炎作用的Th1類細胞因子在此模型中也存在異常高表達，與臨床銀屑病患者的細胞因子表達譜相符合[12]，Shibata等[13]也有類似的研究結果。

值得注意的是，與Quaglino等[14]的臨床研究結果不同，具有抑炎效應的Th2細胞因子和具有免疫調節作用的Treg細胞因子在該銀屑病樣模型中也顯著升高，并且脾細胞中Treg細胞(CD4+CD25+Foxp3+)比例升高，約為正常對照小鼠的2倍，這與Zhang等[15]的研究結果一致。Treg細胞、Th2細胞與Th1、Th17細胞之間的相互作用對維持免疫反應與病理損傷之間的平衡是很重要的。我們推測在銀屑病發病過程中由于Th17或Th1細胞的大量浸潤，打破了這個免疫平衡，Treg細胞或Th2細胞代償性地募集至皮損區域，作為一種反饋機制抑制IL-17或IFN-γ所誘導的炎癥反應，盡管如此，Th17和Th1細胞因子仍處于優勢地位，使銀屑病呈現出炎癥爆發的表現。因此在皮損組織及血清中存在IL-4及IL-10等細胞因子水平的升高，這只是Th1和Th17細胞免疫應答爆發的反饋效應，而不是IMQ的直接誘導作用所致。綜合以上資料，Th17 及Th1細胞介導的免疫反應在IMQ誘導的銀屑病樣模型中起著主導作用。

通過對脾細胞成分進行流式細胞術檢測發現，與正常對照組小鼠相比，IMQ組小鼠脾細胞中CD11c+樹突狀細胞比例顯著增高，外周血中細胞成分也發生了相似的變化，并且之前的研究我們已證實在IMQ誘導的小鼠皮損組織中有樹突狀細胞的大量浸潤[7]，由此可見IMQ外用可誘導小鼠外周及皮損區樹突狀細胞的增殖及募集。樹突狀細胞是分泌IL-23的主要細胞[16]，IMQ組小鼠皮損區IL-23mRNA及IL-23蛋白的高表達可能是由于浸潤的樹突狀細胞分泌所致。IL-23是Th17細胞增殖及活化的上游分子，該模型中Th17細胞因子的高表達可能是IL-23高表達的結果。在脾細胞中我們也發現Th17(CD4+IL-17+)細胞的比例的顯著升高，約為正常對照小鼠的3～4倍；而Th1細胞比例與正常對照組相比沒有明顯的變化。由此提示，Th17細胞及其細胞因子在IMQ誘導的動物模型中可能發揮著更為重要的作用。

漿細胞樣樹突狀細胞和巨噬細胞是表達TLR7/8的主體細胞，IMQ與TLR7/8結合后可啟動IFN-α的大量分泌[17]，IFN-α誘導樹突狀細胞成熟活化[18]并分泌IL-23，后者作用于Th17細胞，介導Th17細胞免疫反應。這可能是IMQ誘發小鼠皮損組織及血清中IL-23/IL-17軸相關細胞因子大量表達的原因。

實驗中我們也發現，IMQ外涂于皮膚后，IL-23 mRNA和Th17類細胞因子mRNA表達均呈一個動態變化的過程。在第4～6天，這些因子的mRNA表達水平達到高峰，隨后表達水平開始下降。IMQ作用后IL-23/IL-17軸相關細胞因子 mRNA先升后降的動態變化規律導致Th17細胞介導的炎癥反應不能持續存在，從而出現皮損的動態變化。但是該模型皮損的表現在第7～8天最為嚴重，可能由于mRNA轉錄、蛋白翻譯表達等時間的延遲所致。目前尚不清楚究竟是何種耐受機制使IMQ不能引發持續的炎癥反應，也未見IMQ在臨床使用出現藥物耐受的報道。

綜合以上結果，IMQ誘導小鼠產生的皮損癥狀、病理學特征及細胞因子改變都與銀屑病相似，是進行銀屑病研究可行的動物模型。該模型操作簡單，消耗較少，易于推廣。此模型的前8 d可模擬疾病的發展階段，第6～8天為變化高峰。Th17細胞活化及IL-23/IL-17軸參與了IMQ誘導的小鼠銀屑病樣皮損的形成，并呈現一個先升高后降低的動態變化過程。Th1細胞介導的炎癥反應也參與了該模型皮損的形成，并且伴隨Treg 和Th2類細胞因子的反饋性升高。

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RoleofIL-23/IL-17inflammatoryaxisinthepathogenesisofpsoriasis-likelesionsinducedbyimiquimodinmice

ZHAO Jing-xia1,2, DI Ting-ting2, WANG Yan2, LIU Xin2，LIANG Dai-ying2，LI Ping1,2

(1SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China;2BeijingInstituteofTraditionalChineseMedicine,BeijingHospitalofTraditionalChineseMedicineAffiliatedtoCapitalMedicalUniversity,Beijing100010,China.E-mail:liping411@yahoo.com.cn)

AIM: To observe the dynamic changes of IL-23/IL-17 inflammatory axis in psoriasis-like lesions of mice induced by imiquimod (IMQ).METHODSBALB/c female mice were randomly divided into control group and IMQ group. The morphological changes of lesional skin in mice were evaluated according to the psoriasis area and severity index (PASI) and HE staining. cytokine antibody chips were used to determine the cytokine changes in serum and lesions. The mRNA and protein expression of cytokines were analyzed by cytometric bead array, real-time PCR and Western blotting. Moreover, the changes of cellular constituents in the peripheral blood and splenic cells of mice were detected by flow cytometry.RESULTSTypical psoriasis-like skin lesions, such as red scaly skin plaques, caused by topical IMQ showed a parabolic dynamic change. There was a dynamic increase in proinflammatory cytokines of the IL-23/IL-17 axis in IMQ-treated skin. IMQ application resulted in elevated expression of cytokines related with IL-23/IL-17 inflammatory axis，Th1-type cytokines，Th2-type cytokines and Treg-type cytokines at day 4. IMQ-treated BALB/c mice showed an increased pericentage of dentric cells in peripheral blood and spleen compared with control animals. Percentages of Th17 and Treg in IMQ-treated mice were increased by 3～4 times and twice as compared with control mice, respectively.CONCLUSIONThe skin lesions, histopathological features and cytokine changes in mice induced by IMQ are similar to human psoriasis, which are suitable for investigating the pathogenesis of psoriasis as a psoriasis-like model. IL-23/IL-17 axis is involved in the formation of psoriasis-like skin lesions in mice induced by IMQ and presents a dynamic change. Besides, Th1 cell-mediated inflammatory response is also activated in the formation of lesional skin, accompanied by the increase expression of Th2 and Treg cytokines in a feedback mechanism.

Psoriasis; Imiquimod; Interleukin-23/interleukin-17 axis; Th17

R392

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.023

1000- 4718(2013)06- 1086- 09

2013- 03- 15

2013- 04- 24

國家自然科學基金資助項目(No.81072810)

△通訊作者 Tel： 010-52176679； E-mail： liping411@yahoo.com.cn