Apelin及其受體和一氧化氮合酶在氧誘導的新生小鼠增生性視網膜病變中表達上調*

伍蒙愛, 陳婕靈, 王 維, 陳惠惠, 劉園園, 楊姍姍, 胡良岡, 范小芳, 龔永生△

(1溫州醫學院低氧醫學研究所，浙江 溫州 325035; 2溫州醫學院附屬眼視光學院，浙江 溫州 325003)

Apelin及其受體和一氧化氮合酶在氧誘導的新生小鼠增生性視網膜病變中表達上調*

伍蒙愛1，2, 陳婕靈1，2, 王 維1, 陳惠惠2, 劉園園2, 楊姍姍2, 胡良岡1, 范小芳1, 龔永生1△

(1溫州醫學院低氧醫學研究所，浙江 溫州 325035;2溫州醫學院附屬眼視光學院，浙江 溫州 325003)

目的通過觀察apelin及其受體APJ和一氧化氮合酶(NOS)在氧誘導的新生小鼠增生性視網膜病變中的表達，探討apelin/APJ和一氧化氮(NO)是否參與了早產兒視網膜病變新生血管的發生。方法36只7日齡C57BL/6J新生小鼠隨機均分為高氧組和對照組。高氧組暴露在75%±2%的氧濃度下5 d后，在正常空氣環境下飼養5 d；對照組小鼠在正常氧環境下飼養10 d。兩組均在17日齡處死，取左眼眼球做石蠟切片，HE染色計數突破內界膜的血管內皮細胞核數，以判斷造模是否成功。實時熒光定量PCR檢測右眼視網膜組織apelin和APJ mRNA的表達，免疫熒光組織化學法檢測視網膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表達。結果高氧組視網膜平均每個切面突破內界膜的血管內皮細胞核數(35.13±10.13)明顯高于對照組(0.30±0.21，P<0.01)，說明造模成功。高氧組apelin和APJ mRNA水平顯著高于對照組，分別為對照組的32.2倍和17.6倍(均P<0.01)。組織免疫熒光結果顯示高氧組apelin和APJ蛋白表達明顯強于對照組，并且主要強表達于新生血管周圍；高氧組eNOS和iNOS蛋白表達明顯強于對照組，但主要強表達于新生血管下方視網膜組織，在突破內界膜的血管內皮細胞核周圍未見表達明顯增強。結論Apelin/APJ及NOS可能與氧誘導的新生小鼠增生性視網膜病變新生血管的發生有關。

Apelin； 視網膜； 新生血管形成； 氧誘導的視網膜病變； 早產兒視網膜病變

早產兒視網膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是發生于早產兒的一種嚴重致盲性視網膜病變，其發病與出生后吸氧治療等密切相關，但ROP的發病機制仍未完全闡明，已有的研究顯示視網膜新生血管的形成可能起主導作用。本研究在氧誘導視網膜病變(oxygen-induced retinopathy，OIR)的新生小鼠模型上，探討血管生長刺激因子apelin及其受體APJ、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)是否參與了視網膜新生血管的發生，為預防和治療ROP提供新的思路與實驗依據。

材 料 和 方 法

1材料

1.1主要試劑 兔多克隆apelin和APJ抗體購自Santa Cruz，兔多克隆eNOS和iNOS抗體購自武漢博士德公司，Trizol和山羊抗兔IgG綠色DyLight 488熒光標記Ⅱ抗購自Invitrogen，Quantscript RT Kit和Real Master Mix(Probe)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2設備 實驗動物常壓高氧氧艙，由我校低氧醫學研究所自制；CYES II型O2氣體測定儀；Beckman核酸蛋白測定儀；尼康倒置熒光顯微鏡;ABI StepOnePlus實時熒光定量PCR儀。

1.3動物 7日齡的清潔級健康C57BL/6J乳鼠36只，母鼠7只，由溫州醫學院實驗動物中心提供。

2方法

2.1OIR模型的建立 高氧環境通過常壓高氧氧艙實現，具體是在自制的氧艙里充入濃度接近100%的醫用氧氣，使艙內氧濃度維持在75%±2%。每24 h更換墊料、食物和鈉石灰。將36只7日齡乳鼠隨機均分成高氧組和對照組。將高氧組乳鼠分成2窩，每窩由2只母鼠間隔6 h交替進入氧艙喂養，乳鼠持續在氧艙生長5 d，再返回正常氧氣環境飼養5 d。對照組乳鼠在空氣中飼養10 d。

2.2組織取材 用0.3%戊巴比妥鈉麻醉后處死乳鼠，取右眼放入0.1% DEPC水中，在解剖顯微鏡下用角膜剪沿眼球角鞏膜緣剪開，去除角膜、虹膜、晶狀體和玻璃體。將視網膜與鞏膜及視網膜色素上皮層分離后，待測apelin和APJ。取左眼眼球置入4%多聚甲醛4 ℃固定24 h，常規石蠟包埋、切片，用于病理組織學檢查和免疫組織化學熒光檢測。

2.3病理組織學檢查 于左眼眼球平行角膜至視神經的矢狀位連續6 μm切片，間隔30 μm取1張切片，每只眼球取10張切片。切片經HE染色行常規病理學檢查，光學顯微鏡下觀察結果。統計平均每只眼球每張切片突破內界膜的血管內皮細胞核數。計數時僅計數與內界膜有緊密聯系的血管內皮細胞核，不包括與內界膜無聯系的玻璃體腔內的其它血管內皮細胞核。

2.4實時熒光定量PCR 按Trizol說明書提取實驗各組小鼠視網膜的總RNA，測定A260/A280的比值(1.8～2.0)及總RNA含量。Quant Reverse Transcriptase一步法逆轉錄成cDNA，TaqMan探針法行實時定量PCR擴增，反應條件為：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環。每個樣本做3個復孔。TaqMan探針由ABI公司提供，小鼠內參照β-actin探針號為Mm00607939，apelin探針號為Mm00443562，APJ探針號為Mm00442191。以10倍稀釋模板梯度樣本進行實時定量PCR反應，目標基因與內參照基因擴增效率接近100%情況下，以內參照基因作為標準進行相對定量，采用2-ΔΔCT計算apelin和APJ相對水平。ΔCT= CT目標基因- CT內參照基因；ΔΔCT=ΔCT高氧組-ΔCT對照組。

2.5免疫熒光組織化學法 取視網膜石蠟切片，經常規脫蠟水化后，PBS洗滌3次，正常山羊血清室溫封閉1 h，分別加入apelin、APJ、eNOS和iNOS Ⅰ抗(1∶100)4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，羊抗兔488標記的熒光Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，DAPI復染細胞核5 min，PBS洗滌3次，抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察，488標記的羊抗兔IgG染apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白呈綠色熒光，DAPI染細胞核的顏色為藍色熒光。設陰性對照，以PBS替代Ⅰ抗。

3統計學處理

數據用均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，兩組間均數比較采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1視網膜新生血管內皮細胞核計數及實驗動物成模率

對照組18只眼180張切片中，共計5張切片可見極少數突破內界膜的視網膜新生血管芽，其細胞核數為1～2個，余175張切片均未見視網膜新生血管芽，見圖1A；高氧組12眼120張切片均可見突破內界膜的視網膜新生血管芽，血管腔切面呈不規則擴張，成模率100%，見圖1B。對照組18眼180張切片中視網膜新生血管內皮細胞核數，平均每張切片為(0.30±0.21)，少于1個，而高氧組12眼120張切片中視網膜新生血管內皮細胞核數，平均每張切片為(35.13±10.13)個，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.01)。

Figure 1. HE staining of retinal paraffin sections (×200). A: control group, the retina showing good and complete structure, without neovascular endothelial cell nuclei extending from retinal area into vitreous area; B: high-oxygen group, the retina showing slightly disordered structure, with many neovascular endothelial cell nuclei extending from retinal area into vitreous area (white arrows), and dilated blood vessels close to retinal surface (blue arrow).

圖1視網膜石蠟切片HE染色

2視網膜組織apelin和APJmRNA表達結果

高氧組apelin mRNA表達水平比對照組高32.2倍(P<0.01)；高氧組APJ mRNA表達水平比對照組高17.6倍(P<0.01)，見表1。

3視網膜apelin、APJ、eNOS和iNOS蛋白的表達

3.1Apelin蛋白表達的分布特點 細胞核熒光染料DAPI染色顯示為藍色熒光，apelin蛋白表達陽性染色顯示為綠色熒光。對照組小鼠視網膜內界膜完整，未見內皮細胞核突破，整個視網膜未見apelin表達，見圖2A。高氧組可見許多藍色細胞核突破內界膜，在這些細胞核周圍可見有大量apelin蛋白表達，此外，在神經節細胞層、神經纖維層血管及深層擴張的血管周圍也可見綠色熒光apelin蛋白表達，見圖2B。

表1實時熒光定量PCR檢測視網膜組織apelin和APJmRNA的表達水平

Table 1. The expression levels of apelin and APJ mRNA in retinal tissues detected by real-time fluorescence quantitative PCR (ΔCT. Mean±SD.n=9)

GroupApelinAPJControl7.391±1.9079.37±1.23High-oxygen2.383±0.353**5.24±1.29**

**P<0.01vscontrol group.

Figure 2. The expression of apelin protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×200). A: control group; B: high-oxygen group.

圖2視網膜組織apelin蛋白的免疫熒光染色

3.2APJ蛋白表達的分布特點 細胞核顯示為藍色熒光，APJ蛋白表達陽性染色為綠色熒光。APJ蛋白的表達特點與apelin相似。對照組視網膜未見明顯綠色熒光的APJ蛋白，見圖3A；高氧組可見綠色熒光APJ蛋白在突破內界膜的內皮細胞核周圍，深層擴張的血管周圍強表達，見圖3B。

Figure 3. The expression of APJ protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×200). A: control group; B: high-oxygen group; C: negative control group.

圖3視網膜組織APJ蛋白的免疫熒光染色

3.3eNOS蛋白表達的分布特點 細胞核顯示為藍色熒光，eNOS蛋白表達陽性染色為綠色熒光。正常小鼠綠色熒光eNOS蛋白分布于整個視網膜，在內核層細胞的胞漿和外叢狀層表達顯著，此外在神經節細胞胞漿、內叢狀層、光感受器細胞層、視網膜色素上皮細胞層均可見其表達，見圖4A。高氧組可見eNOS蛋白表達在各層均不同程度增強，在突破內界膜的內皮細胞核周圍亦可見eNOS蛋白表達，但與周圍組織相比表達并未明顯增強，見圖4B。

3.4iNOS蛋白表達的分布特點 細胞核顯示為藍色熒光，iNOS蛋白表達陽性染色為綠色熒光。正常小鼠綠色熒光iNOS蛋白表達主要分布于內叢狀層、內核層、視網膜色素上皮細胞層，神經節細胞層也可見少量分布，見圖5A。高氧組綠色熒光的iNOS蛋白表達特點與eNOS蛋白基本一致，在新生血管下端的內叢狀層表達明顯增強，在突破內界膜的內皮細胞核周圍可見iNOS蛋白表達，但與周圍組織相比表達并未明顯增強，見圖5B。

Figure 4. The expression of eNOS protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×400). A: control group; B: high-oxygen group.

圖4視網膜組織eNOS蛋白的免疫熒光染色

Figure 5. The expression of iNOS protein in retinal tissues (immunofluorescence staining, ×400). A: control group；B: high-oxygen group.

圖5視網膜組織iNOS蛋白的免疫熒光染色

討 論

近年來隨著醫療技術的進步，早產兒的生存率明顯提高，ROP的發生率也呈顯著上升趨勢，然而ROP的發病機制仍未完全闡明。以往學者認為高濃度氧是導致ROP的主要原因，但現有的研究發現ROP的產生與“相對缺氧”有著密切關系。人類胚胎早期視網膜無血管，主要由玻璃體動脈提供營養。胎齡4個月時視網膜血管由視盤開始發生，逐漸向周邊延伸，胎齡8個月血管發育到達鼻側周邊部，直到足月時視網膜顳側血管才發育成熟。因此，早產嬰兒的周邊視網膜血管尚未發育完成。當早產兒處于高濃度氧環境時，視網膜血管收縮、閉塞、停止發育，回至正常氧環境后，視網膜相對缺血缺氧引起大量血管生長刺激因子的釋放，導致新生血管的發生。由于小鼠和大鼠在剛出生時視網膜血管尚未發育完全，因此是研究早產兒視網膜病變的良好動物。大鼠模型通過改變氧艙氧濃度(50% 24 h，10% 24 h，再50% 24 h，如此循環)的方法建立，雖然具有更接近臨床上早產兒吸氧狀態、眼球大而容易操作的優點，但新生血管的發生率低，且與動物品種、甚至同一品種不同實驗室來源等有關[1]，在我們的預實驗中也發現SD大鼠的成模率極低。目前經典的模型是Smith等[2]建立的OIR小鼠模型，該模型視網膜血管新生的發生率可達100%且重復性好[3]，與我們的實驗結果一致。

Apelin是1998年發現的孤兒G蛋白受體APJ的天然配體[4]。1999年發現apelin/APJ在血管系統，特別是血管內皮細胞高度表達[5]。2002年Saint-Geniez等[6]發現apelin/APJ參與了生理性小鼠視網膜血管發生，并且具有獨特的表達方式。2004年Kasai等[7]發現apelin具有促進猴視網膜內皮細胞生長的作用，提示apelin可能是新的血管生長刺激因子。為了進一步研究apelin/APJ在視網膜新生血管發生中的作用，本實驗在氧誘導的OIR小鼠模型上發現高氧組小鼠視網膜apelin及其受體APJ的基因表達明顯上調，這與Kasai等[7]的研究結果一致。2010年Kasai等[8]發現apelin和APJ mRNA在小鼠OIR模型中表達顯著增加，而apelin基因敲除小鼠在同樣的相對缺氧環境下幾乎不產生新生血管，提示apelin/APJ可能是缺氧誘導的視網膜新生血管發生的先決條件。為了進一步探討apelin/APJ在OIR中的作用特點，本研究利用免疫熒光染色檢測apelin和APJ蛋白在視網膜上的表達，發現apelin和APJ蛋白在高氧組，尤其是血管新生的部位(突破內界膜的血管內皮細胞核即新生血管)表達顯著增強，表明apelin/APJ參與了視網膜新生血管的發生。此外在視網膜中間層血管(內叢狀層)和深層血管(外叢狀層)可見血管管腔擴大，apelin/APJ熒光亮度明顯增加，據文獻報道apelin具有擴張血管的作用[9]，推測apelin在此可能起著擴張血管增加血流的作用。

目前關于apelin/APJ促進新生血管形成的分子機制尚不十分清楚。有報道發現在心血管系統，apelin通過激活eNOS引發內皮細胞釋放NO，產生強有力的內皮依賴的血管擴張作用[10]，給予NOS抑制劑后，apelin的降壓作用被抑制，提示NO是apelin發揮作用的下游信號分子[11]。同時，許多研究表明NO在新生血管的形成中發揮重要的作用，NO是內皮細胞的存活因子，可以抑制內皮細胞凋亡，促進內皮細胞增殖、遷移，血管生長刺激因子如VEGF、TGF-β、bFGF均可引起內皮細胞釋放NO[12]，并且低氧可以上調人臍靜脈內皮細胞iNOS mRNA水平，刺激其釋放NO[13]。本實驗發現高氧組eNOS和iNOS蛋白在光感受器細胞層和內核層、視網膜色素上皮細胞層表達明顯增強，在新生血管下端的內叢狀層亦見強表達，但在突破內界膜的內皮細胞核周圍未見明顯表達，提示eNOS和iNOS參與了視網膜新生血管的發生。eNOS和iNOS在新生血管下方組織的表達增強，釋放的NO可以通過旁分泌間接作用于新生血管內皮細胞，促進內皮細胞存活、增殖和遷移，同時NO能起到擴張血管、增加血流的作用從而間接輔助新生血管的發生，其具體作用機制尚有待進一步研究。目前已有學者設計和發現了apelin受體的拮抗劑[14-15]，早期阻斷apelin受體表達可能有助于抑制血管新生，但其在視網膜血管新生疾病如ROP、增殖性糖尿病視網膜病變中的作用效果有待進一步研究。

本研究在氧誘導的新生小鼠增生性視網膜病變模型上發現，apelin及其受體APJ和NOS參與了ROP視網膜新生血管的發生，但apelin與NOS之間的相互作用尚待進一步研究。

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Up-regulationofapelinanditsreceptoraswellasnitricoxidesynthaseinneonatalmicewithproliferativeretinopathyinducedbyoxygen

WU Meng-ai1,2, CHEN Jie-ling1, 2, WANG Wei1, CHEN Hui-hui2, LIU Yuan-yuan2, YANG Shan-shan2, HU Liang-gang1, FAN Xiao-fang1, GONG Yong-sheng1

(1InstituteofHypoxiaMedicine,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325035,China;2CollegeofOptometryandOphthalmology,WenzhouMedicalCollege,Wenzhou325003,China.E-mail:fxbwzmc@126.com)

AIM: To explore whether apelin and its receptor (APJ) as well as nitric oxide synthase (NOS) were involved in the neovascularization of retinopathy of prematurity by observing their expression characteristics in the retina of a mouse model of oxygen-induced retinopathy.METHODSThirty-six 7-day-old C57BL/6J neonatal mice were randomly divided into high-oxygen group and control group. The mice in high-oxygen group were exposed to 75%±2% oxygen for 5 d, and then changed to normoxia for the next 5 d. The control ones were kept in a normoxic environment for 10 d. The mice in both groups were sacrificed on day 17 of life. The left eyes were isolated to make paraffin sections. The number of endothelial cell nuclei extending from the retinal area into the vitreous area was counted under microscope with HE staining to judge whether the model was successfully established, and immunofluorescence was performed to detect the protein expression of apelin, APJ, eNOS and iNOS. The retinas of the right eyes were dissected for applying real-time fluorescence quantitative PCR to detect the mRNA levels of apelin and APJ.RESULTSThe number of neovascular endothelial cell nuclei extending from the retinal area into the vitreous area in high-oxygen group was much higher than that in control group (35.13±10.13vs0.30±0.21,P<0.01).The mRNA levels of apelin and APJ were higher than those in control group (P<0.01), by 32.2 times and 17.6 times, respectively. The expression of apelin and APJ proteins was significantly increased in high-oxygen group, mainly around the neovessels. The expression of eNOS and iNOS proteins was also significantly increased in high-oxygen group, mainly in the retinal tissue under the neovessels, but not around the neovascular endothelial cell nuclei .CONCLUSIONApelin and its receptor as well as NOS may be involved in the neovascularization in oxygen-induced retinopathy.

Apelin; Retina; Neovascularization; Oxygen-induced retinopathy; Retinopathy of prematurity

R774.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.022

1000- 4718(2013)06- 1081- 05

2012- 09- 19

2013- 04- 23

浙江省自然科學基金資助項目(No.Y2091033)；浙江省大學生科技創新項目(No.2010R413012)；高原醫學教育部重點實驗室(第三軍醫大學)資助項目(No.2009GK04;No.2011JSGY07)

△通訊作者 Tel： 0577-86699521； E-mail： fxbwzmc@126.com