PIG7與丙戊酸促進人白血病細胞SKNO-1的分化和凋亡*

邢海燕， 陳一瑞， 劉家卓， 唐克晶， 田 征， 饒 青， 王 敏， 王建祥

(中國醫學科學院，北京協和醫學院血液學研究所，血液病醫院，實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020)

PIG7與丙戊酸促進人白血病細胞SKNO-1的分化和凋亡*

邢海燕▲， 陳一瑞▲， 劉家卓#， 唐克晶， 田 征， 饒 青， 王 敏， 王建祥△

(中國醫學科學院，北京協和醫學院血液學研究所，血液病醫院，實驗血液學國家重點實驗室，天津 300020)

目的研究p53誘導基因 7(PIG7)對人白血病細胞SKNO-1的作用及組蛋白脫乙酰酶抑制劑丙戊酸(VPA)的協同效應。方法SKNO-1細胞經不同濃度的VPA(1～10 mmol/L)分別作用后，用MTT法檢測VPA對SKNO-1細胞增殖的影響。通過病毒包裝及感染系統分別將帶有PIG7開放讀碼框和反義寡核苷酸片段的慢病毒載體導入SKNO-1細胞，用RT-PCR及Western blotting檢測SKNO-1細胞中PIG7 的mRNA及蛋白表達情況；用流式細胞術檢測VPA作用于病毒感染后SKNO-1細胞的凋亡率和分化抗原CD11b的表達； DNA ladder實驗分析細胞的凋亡。結果VPA可明顯抑制SKNO-1細胞增殖，且具有時間、劑量依賴性。過表達PIG7促進SKNO-1細胞的凋亡和分化, 聯合VPA作用后細胞分化抗原CD11b的表達水平和細胞凋亡率明顯高于空載體組(P<0.05)，并出現典型的DNA梯狀條帶。結論VPA具有抑制SKNO-1細胞增殖和誘導其分化及凋亡的作用。過表達PIG7可促進SKNO-1細胞的凋亡和分化，并增加SKNO-1細胞對VPA的敏感性。過表達PIG7聯合VPA有望成為白血病治療的新策略。

p53誘導基因7； 丙戊酸； 組蛋白脫乙酰酶； 白血病； 細胞凋亡

p53介導的凋亡是DNA受損細胞的重要凋亡途徑，對于維持細胞基因組的穩定性起重要作用。p53誘導基因7 (p53-inducible gene 7,PIG7)是p53誘導細胞凋亡過程中涉及的關鍵基因之一，在乳腺癌、B細胞淋巴瘤、黑色素瘤及急性白血病中表達明顯下調[1-4]。應用蛋氨酸誘導黑色素瘤細胞凋亡、全反式維甲酸誘導NB4細胞分化及苯丁酸鈉誘導Kasumi-1細胞凋亡的過程中，PIG7表達上調。因而，PIG7的異常在白血病和腫瘤的發生發展中可能起到重要作用。組蛋白脫乙酰酶(histone deacetylase, HDAC)水平與多種腫瘤的發生發展相關,而HDAC抑制劑(histone deacetylase inhibitor, HDACi)可通過促進組蛋白乙酰化，上調相關抑癌基因表達，發揮抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化或促進凋亡的作用。丙戊酸(valproic acid，VPA)是目前臨床應用廣泛的抗癲癇藥物，因其也具有很強的HDACi活性，近來在白血病及多種實體瘤中顯現出較好的抗腫瘤效應，但其具體作用機制尚未明了[5]。本研究利用慢病毒感染系統將PIG7導入攜帶有AML1-ETO融合基因的人白血病細胞系SKNO-1中，研究VPA與PIG7對細胞凋亡和分化的作用。

材 料 和 方 法

1材料

293T細胞為本室保存，SKNO-1細胞由上海交通大學醫學院陳國強教授惠贈。帶有PIG7開放讀碼框慢病毒表達載體pCDH-PIG7和PIG7反義RNA慢病毒載體pCDH-anti-PIG7 為本室構建，包裝質粒為本室保存。VPA購自Sigma，小鼠抗人PIG7抗體購自Abcam和小鼠抗人β-actin抗體購自Sigma。

2方法

2.1細胞培養 293T和SKNO-1細胞分別培養于含10%胎牛血清的DMEM和15%胎牛血清的RPMI-1640(Gibco)完全培養基，其中SKNO-1細胞需補充10 μg/L 人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophage colong-stimulating factor,hGM-CSF)，置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。

2.2細胞對藥物敏感性的MTT測定 SKNO-1細胞用培養基調整細胞密度為5×108/L，接種于96孔培養板，每孔100 μL，每組設3個平行孔，VPA濃度分別為0、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5和10 mmol/L，處理24 h、48 h和72 h后，每孔加5 g/L MTT 10 μL，繼續培養4 h，每孔加入50 μL 10% SDS (含5 mmol/L HCl)，振蕩混勻，37 ℃孵育過夜。用酶標儀檢測各孔吸光度，根據吸光度計算細胞生長抑制率，根據線性回歸方程求出VPA的半數抑制濃度(IC50)，選擇合適的VPA濃度進行細胞凋亡和分化的檢測。

2.3細胞轉染和病毒制備 轉染前24 h將5×106293T細胞接種于10 cm培養板中，培養至50%～70%匯合度時進行磷酸鈣沉淀法轉染。分別于轉染后48 h、60 h和72 h 收集培養上清于50 mL 離心管中，室溫1 000 r/min離心10 min，收集上清；使用0.45 μm濾器過濾病毒上清后，置于50 mL超速離心管中，4 ℃、50 000×g離心90 min，棄上清；以培養上清1/50體積加入無血清DMEM，重懸病毒沉淀，分裝后置-80 ℃冰箱保存。

2.4慢病毒感染及VPA處理SKNO-1細胞 將對數生長期的SKNO-1細胞以2×105/well接種于24孔板中，加入以無血清DMEM稀釋至500 μL 的病毒液及6 mg/L polybrene，6 h后換新鮮的含10% FBS的 RPMI-1640培養液繼續培養。

后續實驗分為pCDH空病毒感染組、pCDH-PIG7感染組、pCDH-anti-PIG7感染組、pCDH+VPA(1或2 mmol/L)處理組、pCDH-PIG7+VPA處理組和pCDH-anti-PIG7+VPA處理組。

2.5PIG7 mRNA及蛋白表達檢測 收集各組細胞分別進行RT-PCR及Western blotting分析PIG7的 mRNA及蛋白表達。PIG7引物序列： 5’-GCAGTACGGTCTACGTGCAG-3’，5’-CTTGTAGGTGCCCAGGAGAG-3’，擴增片段長251 bp。GAPDH引物序列：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’， 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’，擴增片段長度225 bp。

細胞經RIPA細胞裂解液裂解后，進行聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳，用半干電轉儀將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，1∶2 000稀釋的小鼠抗人PIG7抗體和小鼠抗人β-actin抗體室溫孵育1 h后，置于4 ℃過夜，1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠Ⅱ抗室溫孵育1 h，化學發光法顯影。

2.6Annexin-V/7-AAD檢測細胞凋亡 收集各組細胞，重懸于1×binding buffer并調節細胞濃度為1×109cells/L。取100 μL細胞懸液于流式管中，加入5 μL annexin-V/PE和(或)5 μL 7-AAD， 混勻后室溫避光孵育15 min，在反應管中補加200 μL 1×binding buffer，流式細胞儀檢測，比較pCDH-PIG7組及pCDH-anti-PIG7單獨或聯合VPA組(1或2 mmol/L)細胞凋亡率的變化。

2.7DNA梯形片段電泳分析 離心收集2×106細胞，用1 mL裂解液吹打混勻，加入10 g/L RNase A 2 μL，37 ℃孵育2 h。再加入20 g/L蛋白酶K 5 μL，37 ℃消化3 h。Tris 飽和酚抽提1次，氯仿/異戊醇抽提2次，無水乙醇沉淀。將沉淀溶于TE 緩沖液，置于4 ℃ 24 h 以上，使其充分溶解，2%瓊脂糖凝膠電泳，照相。

2.8細胞分化抗原檢測 取1×106細胞，用含0.1% NaN3的PBS洗滌2次，加入5 μL PE標記的人CD11b單克隆抗體，常溫避光孵育30 min，PBS洗滌，加入1%多聚甲醛PBS 300 μL固定，在2 h內進行流式細胞術檢測。

3統計學處理

采用SPSS 10.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差(mean±SD)表示，組間均數比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1慢病毒感染及VPA處理后SKNO-1細胞PIG7的表達

pCDH-PIG7感染組及pCDH-PIG7+VPA處理組的PIG7 mRNA和蛋白表達水平顯著上調，感染pCDH-anti-PIG7病毒的SKNO-1細胞PIG7 mRNA和蛋白的表達明顯受到抑制，見圖1。

Figure 1. The expression of PIG7 induced by lentivirus infection and VPA treatment. High levels of PIG7 product were detected in pCDH-PIG7 group, pCDH+VPA group and pCDH-PIG7+VPA group by RT-PCR (A) and Western blotting (B) after infected with lentivirus for 48 h. The up-regulated PIG7 expression was significantly abrogated by pCDH-anti-PIG7.

圖1病毒感染和VPA處理SKNO-1后PIG7的表達

2PIG7及VPA對SKNO-1細胞分化的影響

分別用0、0.15、0.30、0.60、1.25、2.50、5和10 mmol/L VPA處理SKNO-1細胞24 h、48 h和72 h，MTT結果顯示，VPA顯著抑制SKNO-1細胞的生長，并且有時間和劑量依賴性。pCDH-PIG7感染組CD11b陽性率 (17.1%) 較pCDH感染組 (8.2%) 明顯升高 (P<0.05)。經1 mmol/L和2 mmol/L VPA處理后，pCDH-PIG7組CD11b分別升高到30.4%和42.4%，顯著高于pCDH+VPA組(P<0.05)。而轉染pCDH-anti-PIG7的SKNO-1細胞經VPA處理前后CD11b陽性率均顯著低于pCDH-PIG7組 (P<0.05)，見圖2。

3PIG7及VPA對SKNO-1細胞凋亡的影響

3.1Annexin-V/7-AAD檢測 pCDH-PIG7組細胞凋亡比例為20.3%，較pCDH組(6.8%)明顯升高(P<0.05)。經1 mmol/L 和 2 mmol/L VPA處理后pCDH-PIG7組凋亡細胞分別升高至29.9%和61.4%，顯著高于pCDH組的12.4%和40.5%(P<0.05)。轉染pCDH-anti-PIG7的SKNO-1細胞經VPA處理前后細胞凋亡率均比pCDH-PIG7組明顯降低 (P<0.05)，見圖3。

Figure 2. The differentiation of SKNO-1 cells after lentivirus infection and VPA treatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05vspCDH alone;#P<0.05vspCDH-PIG7 with the same concentration of VPA.

圖2病毒感染和VPA處理SKNO-1前后細胞分化抗原CD11b的表達

Figure 3. The apoptosis of SKNO-1 cells after lentivirus infection and VPA treatment.Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vspCDH alone;#P<0.05vspCDH-PIG7 with the same concentration of VPA.

圖3病毒感染和VPA處理對SKNO-1細胞凋亡的影響

3.2DNA梯形片段電泳分析 轉導pCHD-PIG7的SKNO-1細胞出現凋亡的典型梯形條帶，經VPA處理后，pCDH-PIG7感染組的梯形條帶比pCDH組及pCDH-anti-PIG7組更為明顯，見圖4。

Figure 4. Typical DNA ladder was observed after lentivirus infection and VPA treatment in pCDH-PIG7 group and VPA group, especially in pCDH-PIG7+VPA group. No DNA ladder was observed in pCDH group and pCDH-anti-PIG7 group.M: marker.

圖4病毒感染和VPA處理SKNO-1細胞后細胞凋亡的DNA梯形條帶

討 論

PIG7，又稱脂多糖誘導的腫瘤壞死因子α因子(lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor-alpha factor，LITAF) 或 溶酶體/晚期內體小膜內在蛋白(small integral membrane protein of the lysosome/late endosome， SIMPLE)，其羧基端含有高度保守的SIMPLE-樣結構域，氨基端含有2個PPXY元件介導蛋白之間的相互作用。盡管其細胞定位和作用在不同細胞中并不一致，但大多研究認為其在LPS誘導的TNF-α表達過程中起轉錄激活作用，定位于晚期內體/溶酶體、高爾基體或細胞膜，參與蛋白分泌和降解途徑[6-8]。

轉錄因子AML1在胚胎形成初期即已出現并廣泛表達于所有造血細胞，它與抑癌因子核心結合因子β形成異二聚體，通過調節多種造血相關基因來促進造血干細胞的發育和分化。t(8;21)易位形成的特異性融合蛋白AML1-ETO作為轉錄抑制因子，異常募集核輔助抑制復合物N-CoR/mSin3/HDAC，使組蛋白脫乙酰化而抑制AML1靶基因的轉錄，干擾AML1的正常功能，抑制造血干/祖細胞分化成熟，是t(8;21) 急性髓系白血病發生的重要機制。HDACi通過抑制HDAC活性使組蛋白乙酰化，重新激活受抑制的基因，誘導多種腫瘤細胞生長阻滯、分化及凋亡。

研究發現VPA可有效地抑制肝癌細胞HepG2的增殖并誘導其發生線粒體依賴的凋亡，與地西他濱聯合應用可顯著促進胃癌細胞MGC-803的凋亡和G0/G1期的阻滯[9-10]。VPA已在臨床用于治療急性髓系白血病和骨髓增殖性疾病[11-12]。VPA可抑制P糖蛋白(P-gP) 和多藥耐藥相關蛋白(MRP1)高表達的白血病細胞增殖，并誘導其凋亡，但對Bcl-2高表達的白血病細胞卻無能為力[13]。當VPA與Bcl-2的小分子配體HAl4-1聯合應用時可促進高表達Bcl-2的人急性B細胞白血病BALL-1的凋亡，并明顯延長接種了BALL-1細胞的NOD/SCID小鼠的生存期[14]。因而，對多種耐藥白血病應探索新的聯合用藥方案。

我們的前期研究發現，作為一種HDACi,苯丁酸鈉可以誘導t(8;21)白血病細胞系Kasumi-1分化、凋亡，同時伴有PIG7基因表達顯著上調[4]。AML1能夠與PIG7的啟動子區結合并促進PIG7的轉錄和表達，AML1-ETO競爭性拮抗這種活化作用，過表達PIG7能夠促進部分白血病細胞的分化和凋亡[15]。SKNO-1細胞來源于t(8;21)白血病患者，攜帶有特征性AML1-ETO融合蛋白。在SKNO-1細胞中過表達PIG7并加入VPA，SKNO-1細胞的分化和凋亡水平均比單純轉染PIG7或單用VPA顯著升高，表明PIG7的過表達和VPA聯合應用對帶有AML1-ETO融合蛋白的白血病細胞的分化和凋亡具有協同效應，對于臨床聯合用藥具有新的指導意義。推測PIG7和VPA聯合應用可能通過PIG7部分封閉AML1-ETO的作用， 加上VPA抑制HDAC活性， 重新激活因AML1-ETO募集核輔助抑制復合物而表達受阻的基因，誘導白血病細胞的分化凋亡，二者具體作用機制還需更深入的研究。

[1] Abba MC, Drake JA, Hawkins KA, et al. Transcriptomic changes in human breast cancer progression as determined by serial analysis of gene expression [J]. Breast Cancer Res, 2004, 6(5):R499-R513.

[2] Mestre-Escorihuela C, Rubio-Moscardo F, Richter JA, et al. Homozygous deletions localize novel tumor suppressor genes in B-cell lymphomas [J]. Blood, 2007, 109(1):271-280.

[3] Kokkinakis DM, Brickner AG, Kirkwood JM, et al. Mitotic arrest, apoptosis, and sensitization to chemotherapy of melanomas by methionine deprivation stress [J]. Mol Cancer Res, 2006, 4(8):575-589.

[4] Wang D, Liu J, Tang K, et al. Expression ofpig7 gene in acute leukemia and its potential to modulate the chemosensitivity of leukemic cells [J]. Leuk Res, 2009, 33(1):28-38.

[5] Mottet D, Castronovo V. Histone deacetylases: target enzymes for cancer therapy [J]. Clin Exp Metastasis, 2008, 25(2):183-189.

[6] Moriwaki Y, Begum NA, Kobayashi M, et al.MycobacteriumbovisBacillus Calmette-Guerin and its cell wall complex induce a novel lysosomal membrane protein, SIMPLE, that bridges the missing link between lipopolysaccharide and p53-inducible gene,LITAF(PIG7), and estrogen-inducible gene,EET-1 [J]. J Biol Chem, 2001, 276(25):23065-23076.

[7] Eaton HE, Desrochers G, Drory SB, et al. SIMPLE/LITAF expression induces the translocation of the ubiquitin ligase itch towards the lysosomal compartments [J]. PLoS One, 2011, 6(2):e16873.

[8] Eaton HE, Metcalf J, Lacerda AF, et al. Accumulation of endogenous LITAF in aggresomes [J]. PLoS One, 2012, 7(1):e30003.

[9] Wang W, Liao XL, Chen JH, et al. Sodium valproate induces mitochondria-dependent apoptosis in human hepatoblastoma cells [J]. Chin Med J (Engl), 2011, 124(14):2167-2172.

[10] 張國強, 彭敏霞, 王曄愷, 等. 地西他濱聯合丙戊酸鈉促進胃癌MGC-803細胞凋亡和G0/G1期阻滯的機制研究[J]. 中國病理生理雜志，2012，28(10):1856-1860.

[11] Kuendgen A, Schmid M, Schlenk R, et al. The histone deacetylase (HDAC) inhibitor valproic acid as monotherapy or in combination with all-transretinoic acid in patients with acute myeloid leuke-mia [J]. Cancer, 2006, 106(1):112-119.

[12] Voso MT, Santini V, Finelli C, et al. Valproic acid at therapeutic plasma levels may increase 5-azacytidine efficacy in higher risk myelodysplastic syndromes [J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(15):5002-5007.

[13] Tang R, Faussat AM, Majdak P, et al. Valproic acid inhibits proliferation and induces apoptosis in acute myeloid leukemia cells expressing P-gp and MRP1 [J]. Leukemia, 2004, 18(7):1246-1251.

[14] 薛紅漫, 陳 純, 張建瑜, 等. VPA聯合HA14-1對Bcl-2高表達的BALL-1 細胞作用的實驗研究[J]. 中國病理生理雜志, 2006, 22(11):2227-2230.

[15] Liu J, Xing H, Chen Y, et al. PIG7, transactivated by AML1, promotes apoptosis and differentiation of leukemia cells withAML1-ETOfusion gene [J]. Leukemia, 2012, 26(1):117-126.

PIG7andvalproicacidpromotedifferentiationandapoptosisofhumanleukemiaSKNO-1cells

XING Hai-yan, CHEN Yi-rui, LIU Jia-zhuo, TANG Ke-jing, TIAN Zheng, RAO Qing, WANG Min, WANG Jian-xiang

(StateKeyLaboratoryofExperimentalHematology,InstituteofHematology&BloodDiseaseHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Tianjin300020,China.E-mail:wangjx@ihcams.ac.cn)

AIM: To investigate the synergistic effect of p53-inducible gene 7 (PIG7) and histone deacetylase (HDAC) inhibitor valproic acid (VPA) on the differentiation and apoptosis of human leukemia SKNO-1 cells.METHODSThe DNA fragments containingPIG7 open reading frame or antisense oligonucleotides were subcloned into lentiviral vector. SKNO-1 cells were transduced with prepared lentivirus. Transgene expression was detected by semi-quantitative RT-PCR and Western blotting. The expression of myeloid cell differentiation antigen CD11b and the apoptotic cells were analyzed by flow cytometry. DNA fragmentation analysis was also used to observe the apoptosis of SKNO-1 cells.RESULTSVPA inhibited the proliferation of SKNO-1 cells in a dose- and time-dependent manner. Compared with control group, the differentiation and apoptosis of SKNO-1 cells were significantly induced by ectopically expressed PIG7 (P<0.05). The apoptosis induced by ectopically expressed PIG7 was further enhanced by VPA treatment (P<0.05), and the typical DNA ladders were also observed. The proportion of CD11b+SKNO-1 cells notably increased after infection with lentivirus containingPIG7 as compared with empty vector group (P<0.05). Up-regulation of PIG7 also enhanced the susceptibility of the cells to the induction of differentiation by VPA.CONCLUSIONVPA inhibits the proliferation and induces the differentiation and apoptosis of SKNO-1 cells. Enforced expression of PIG7 enhances the differentiation and apoptosis of SKNO-1 cells and promotes the sensitivity of SKNO-1 cells to VPA. Over-expression of PIG7 combined with VPA may provide a new strategy for treatment of leukemia.

p53-inducible gene 7; Valproic acid; Histone deacetylase; Leukemia; Apoptosis

R733.7

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.009

1000- 4718(2013)06- 1009- 05

2012- 12- 05

2013- 05- 02

國家自然科學基金資助項目(No.30971290;No.81270635)

△通訊作者 Tel： 022-23909120； E-mail: wangjx@ihcams.ac.cn

▲共同第一作者

#現工作單位： 四川大學華西醫院血液科， 四川 成都 610041