吳茱萸堿對SGC－7901 細胞周期和細胞凋亡的影響

張元新，葛雅琨

(吉林化工學院化工與生物技術學院，吉林省吉林市 132022)

吳茱萸是蕓香科植物吳茱萸、石虎及梳毛吳茱萸成熟的果實［1］。吳茱萸堿(Evodiamine，Evo)是從吳茱萸中提取出的主要活性生物堿之一，其分子式為C19H17N3O。近年來的研究表明吳茱萸堿對多種腫瘤細胞，如腎癌細胞［2］、前列腺癌［3］、乳腺癌［4］、黑色素瘤［5］，宮頸癌［6］，胃癌［7］，結腸癌［8］等具有抑制作用。

胃癌是世界上最常見的癌癥之一，僅次于肺癌，位居第二，每年全球大約有800，000人死于此病［9］。其中大約有三分之二的新生病例和死亡病例是發生在欠發達國家和地區。日本、中國、韓國、中南美洲、東歐以及中東部分地區是胃癌的高發區;而北美、澳大利亞、新西蘭、北歐和印度的發病率較低［10－11］。胃癌患者的五年的生存率不足20%。對于那些早期診斷的患者，應用內窺鏡粘膜切除術(Endoscopic mucosal resection，EMR)可以對其進行治療;目前這種外科手術的方式也只能治愈不到40%的病例，大多數胃癌都發生了轉移，最后只能依靠輔助化療的方式對其進行治療。對晚期和復發的患者，化療成了主要治療手段。因此，高效、低毒并具有新作用機制的抗腫瘤藥物的研究迫在眉睫。本研究探討了吳茱萸堿誘導胃癌細胞SGC－7901 的凋亡作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

吳茱萸堿(Evodiamine)購自SIGMA 公司。Anti－Caspase 3、β－actin 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG 抗體均購自Santa Cruz 公司;新生牛血清、DMEM 培養基購自Gibco 公司;PVDF 膜(0.22 μm)，Millipore 公司;預染蛋白Marker，購自Fermentas 公司。Annexin V－FITC/PI 凋亡檢測試劑盒，BD 公司。

1.2 細胞培養

人胃癌細胞系SGC－7901 細胞購自中國科學院細胞庫。SGC－7901 細胞用含10%的新生牛血清的DMEM 培養基，5% CO2、37℃、飽和濕度的恒溫孵育箱培養。

1.3 MTT 實驗

將對數生長期的細胞SGC－7901 以5 × 103個/孔濃度接種于96 孔板中培養過夜。用吳茱萸堿(0.000001～100μM)處理SGC－7901 細胞48 h。每個濃度3個復孔，并設空白對照和陰性對照孔。細胞加藥處理后的時間點，分別加入5 mg/ml 的MTT 20 μL，37℃繼續孵育4 h。輕輕吸去孔內的培養基，每孔加入150μl 的二甲基亞砜(DMSO)。在酶標儀中震板10 min，測定490 nm 的光吸收值。計算存活率和抑制率，公式如下:

存活率=實驗組OD 平均值/對照組OD 平均值×100%.

抑制率=(對照組OD 平均值－實驗組OD 平均值)/對照組OD 平均值 × 100% .

1.4 細胞凋亡與細胞周期

將對數生長的細胞以每孔4 × 105個接種于六孔板中，貼壁培養過夜后，按照設計的不同藥物濃度(0.01～100μM)處理細胞。在藥物的作用時間點，把細胞培養液吸出至一個合適的離心管內，PBS 洗滌貼壁細胞一次，加入適量的胰酶消化細胞，37℃孵育2 min，用含血清的培養基終止消化，輕輕吹打細胞，合并在同一離心管中，但避免胰酶的過度消化。1500 rpm，離心3 min，棄上清，收集細胞，用PBS 輕輕重懸細胞并計數。1500 rpm，離心3 min，棄上清，用1 × Loading Buffer 將細胞配成濃度為106 的細胞懸液。取100 μl 細胞懸液分別依次加入5 μl Annexin Ⅴ－FITC和5 μl PI，輕輕混勻后置于室溫下避光染色15 min。向每個染色樣品中加入400 μl 1 × Loading Buffer，用200 目篩網過濾后即可進行凋亡測定。同時另一份樣品加入預冷的1 ml的70% 乙醇在4℃固定12 h 以上。1500 rpm，離心3 min，棄上清，并用預冷的PBS 清洗一次，將液體盡量除盡，加入200 μl 染液(25 mg/ml RNase A 4 μl，PI 20 μl，PBS 186 μl)，37℃孵育30 min，篩網過濾后即可用于細胞周期測定。

1.5 Western－blot

細胞加藥處理后，用預冷的PBS 洗2～3 遍、計數，按2 ×106 細胞加入含蛋白酶抑制劑的裂解液100 μl，在冰上裂解30 min，12000 rpm，4℃，離心10 min，收集上清，進行蛋白定量。含50 μg 總蛋白的樣品溶液作為上樣量，加入5 × SDS Loading Buffer，然后放在金屬浴中100℃煮沸10 min 使蛋白變性。經SDS－PAGE 電泳、轉膜后，移入用TBST 配制的含5% 脫脂奶粉的封閉液中，室溫封閉1 h。加入相應的一抗、二抗孵育，用ECL 發光法檢測不同蛋白的表達情況。

1.6 統計學分析

所有實驗重復3 次，應用SPSS 11.0 軟件進行統計分析，實驗結果以(x± s)表示，以P ＜0.05 具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 吳茱萸堿對SGC－7901 細胞增殖的影響

為了檢測吳茱萸堿對SGC－7901 細胞增殖的影響，分別用吳茱萸堿(0.000001－100μM)處理SGC－7901 細胞48 h。結果表明吳茱萸堿對SGC－7901 細胞的抑制作用具有明顯的量效關系，10μM 的吳茱萸堿對其細胞的抑制作用為53.6 ±1.3%(圖1)。

圖1 吳茱萸堿對SGC－7901 細胞增殖的影響

2.2 吳茱萸堿對SGC－7901 細胞周期的影響

細胞增殖的抑制作用往往與細胞周期的變化密不可分。因此，我們分別用吳茱萸堿(0.01，0.1，1，10，100μM)處理胃癌細胞SGC－7901 48 h，用流式細胞儀檢測細胞周期分布進行情況。結果表明，吳茱萸堿誘導SGC－7901 細胞產生了明顯的G2/M 期阻滯現象。當吳茱萸次堿的濃度為0.1μM時，G2/M 期細胞的比例為19.56 ± 0.98%;當吳茱萸次堿的濃度為1μM時，G2/M 期細胞的比例為41.47 ±1.07%;當吳茱萸堿的濃度達到10，100μM時，G2/M 期細胞的比例分別為88.81 ±1.44%、99.61 ±1.98% (圖2)。這種G2/M 期細胞的增加也同時伴隨著G1、S 期細胞的不斷減少。

圖2 吳茱萸堿對SGC－7901 細胞周期的作用

圖3 吳茱萸堿誘導SGC－7901 細胞凋亡

2.3 吳茱萸堿對SGC－7901 細胞周期的影響

吳茱萸堿對SGC－7901 細胞產生了明顯的抑制作用及G2/M 期阻滯，然而其是否能直接導致其細胞凋亡卻是未知的。我們用吳茱萸堿(0.01，0.1，1，10，100μM)處理胃癌細胞SGC－7901 48 h，用流式雙染法檢測其誘導凋亡情況。結果表明1μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為39.86 ±1.19%;10μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為43.91 ±1.2%;100μM 的吳茱萸堿作用48h 后，其凋亡比例為59.62 ±1.28%。Western－blot分析結果表明，procaspase 3 的表達量隨著吳茱萸堿的作用濃度的增加而逐漸下降，進而激活了caspase 3 而誘導SGC－7901 細胞凋亡。

3 結論

吳茱萸堿是一類喹諾酮類生物堿，作為一種新型的癌癥化療輔劑，它可以提高化療效力及降低副反應的作用。日益增多的證據表明吳茱萸堿具有抑制增殖、誘導凋亡、浸潤、遷移等抗腫瘤活性［12］。另一些研究檢測了吳茱萸堿在小鼠、黑腹果蠅的急性毒性，其LD50分別為77.79 mg/kg、3.58 μg/adult［13－14］。本文用吳茱萸堿處理胃癌細胞SGC－7901，結果顯示其具有明顯的增值抑制和G2/M 期阻滯作用;并激活了caspase 3，誘導細胞凋亡。總之，本研究將為吳茱萸堿的生物活性研究和臨床實驗研究提供有效的實驗數據。

［1］Chiou W.F.，Liao J.F.，Chen C.F.Comparative study of the vasodilatory effects of three quinazoline alkaloids isolated from Evodia rutaecarpa［J］.J.Nat .Prod.，1996，59:374–378.

［2］陳志芬，張志杰，易俊陽，等.吳茱萸堿通過新的機制激活AMP 蛋白激酶的研究［J］.南京中醫藥大學學報，2012，28(4):342－244.

［3］Kan S.F.，Huang W.J.，Lin L.C.，Wang P.S.Inhibitory effects of evodiamine on the growth of human prostate cancer cell line LNCaP［J］.Int.J.Cancer 2004，110:641–651.

［4］LIAO C.H.，PAN S.L.，GUH J.H.，et al.Antitumor mechanism of evodiamine，a constituent from Chinese herb Evodiae fructus，in human multiple－drug resistant breast cancer NC I/ADR－RES cells in vitro and in vivo［J］.Carcinogenesis 2005，26 (5):968－975.

［5］張瑩，張起輝，吳立軍，等.吳茱萸堿誘導A375－S2 細胞死亡過程中對ERK 激酶的調控［J］.中國病理生理雜志，2004，20(12):2175－2179.

［6］Yang J.，Wu L.J.，Tashino S.，er al.Reactive oxygen species and nitric oxide regulate mitochondria－dependent apoptosis and autophagy in evodiamine－treated human cervix carcinoma HeLa cells［J］.Free Radic.Res.2008，42:492–504.

［7］田秀麗，張瑾，王小亮，等.吳茱萸堿對人胃腺癌細胞SGC－7901 作用的研究［J］.北京中醫藥大學學報，2011，34(2):115－118.

［8］張醇，楊雪，范霞.吳茱萸堿對人結腸癌lovo 細胞生長的抑制作用［J］.中國生物制品學雜志，23(8):866－870.

［9］WHO.Cancer.http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/，Globocan 2008，IARC，2010.

［10］Ferlay J.，Bray F.，Pisani P.，Parkin D.M.GLOBOCAN 2002:Cancer incidence，mortality and prevalence worldwide.Lyon:IARCPress，Cited 2005－04－15;Available from:URL:http://wwwdep.iarc.fr/.

［11］Roder D.M.The epidemiology of gastric cancer［J］.Gastric Cancer，2002，5 suppl 1:5－11.

［12］JIANG J.L.，HU C.P.Evodiamine:a novel anti－cancer alkaloid from Evodia rutaecarpa［J］.Molecules 2009，14:1852－1859.

［13］Yang X.W.，Zhang H.，Li，M.，Du L.J.，et al.Studies on the alkaloid constituents of Evodia rutaecarpa (Juss)Benth var.bodinaieri (Dode)Huang and their acute toxicity in mice［J］.J.Asian Nat.Prod.Res.2006，8:697－703.

［14］〗Miyazawa M.，Fujioka J.，Ishikawa Y.Insecticidal compounds from Evodia rutaecarpa against Drosophila melanogaster.J.Sci.Food Agric.，2002，82:1574－1578.