一種小型化SPR生物傳感器的設計與實現*

曾祥華，楊 軍，田 浩，劉琳琳，胡 寧

（重慶大學生物工程學院生物流變科學與技術教育部重點實驗室視覺損傷與再生修復重慶市重點實驗室，重慶 400030）

0 引言

表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）技術是一種重要的生物化學檢測分析方法，具有檢測精度高、樣品不需標記、不需分離純化、可實時動態監測［1］等優點，已經廣泛應用于生物醫學、食品安全以及環境監測等領域［2］。傳統的 SPR檢測裝置體積龐大、價格昂貴［3］，為了滿足越來越廣泛的檢測需求，便攜式、小型化SPR生物傳感器的研究得到了廣泛關注。其中，美國德州儀器（Texas Instruments，TI）公司生產的 Spreeta傳感器［4］最具代表性。該傳感器采用Kretschmann結構，光源采用近紅外光LED，檢測器采用線陣硅光二極管，體積非常小。但是，該傳感器只是一個獨立傳感模塊，需要另外配備流通系統、數據采集模塊以及控制電路等。

因此，本文在此基礎上進行了大量改進，采用了尺寸更大、光學性能更好的不規則四邊形玻璃棱鏡，光學檢測精度和系統集成方面也有了很大提高。同時，系統集成了用于生物樣本溶液流動的流路結構和光學信號采集及分析模塊，實現了一個完整的小型化SPR生物傳感檢測裝置原型。

1 傳感器設計與實現

1．1 基本原理

SPR是一種物理光學現象。當入射光以大于臨界角入射到2種不同折射率的介質界面（如玻璃與其表面的金）時，可引起金屬中自由電子的共振。自由電子吸收了入射光的能量，從而使反射光有一定程度的衰減，其程度與入射角度相關。使反射光下降到最小的入射角稱為SPR角，它的大小依賴于緊靠在金屬薄膜一側的表面介質的折射率。由此可以通過檢測SPR角來判定介質的變化。

1．2 系統結構

SPR生物傳感器（圖1）主要包括光學、傳感反應、檢測、流通、數據采集等模塊以及計算機，能夠實現SPR檢測、待測物的進出樣以及檢測信號的采集、顯示與分析等。檢測時，紅光二極管發出一束發散光入射到一側鍍有金膜的傳感芯片。由于入射光為同一點光源產生的發散光，包含了一定的入射角范圍。當滿足共振條件時，某一角度入射光會在敏感芯片上發生SPR共振。光束通過反光鏡反射到線陣CCD上，線陣CCD［5］上不同的像素點對應著不同的入射角，當檢測到某一區域像素點的光強明顯減弱時，其對應的角度就是SPR共振角。

圖1 小型化SPR傳感裝置Fig 1 Miniaturized SPR sensing device

1．3 光學系統

SPR共振角大小與待測樣品種類、濃度密切相關。入射光角度變化范圍和可檢測反射光范圍越大，能夠檢測的共振角范圍和樣品種類越多、濃度變化范圍也越大。為了使可檢測的入射光角度盡量大，對光源（LED）的位置、傳感界面的尺寸（圖2中b面）和傳感界面與光源所在表面的夾角（圖2（a）中θ）進行了優化。

圖2 棱鏡結構Fig 2 Prism structure

棱鏡外形為六面體（圖2），光路所在截面為一個不規則四邊形。優化后，四邊形abcd邊長分別為6，4，4．6 cm和1．1 cm，棱鏡與光路界面垂直方向的厚度為2cm。棱鏡b面貼有傳感芯片和流通池;c面為反射面，能夠將光反射到線陣CCD上。為了增加入射光的檢測范圍，在尺寸允許的情況下，使b面的尺寸盡可能大。b面與a面的夾角θ為60°，在θ角不是太大（照射在b面上的入射光角度范圍大）的同時，兼顧了2次反射過程中的光路設計。a面下方左側裝有LED，右側裝有線陣CCD，實現光的發射和接收。LED的位置對入射光檢測范圍的影響比前2個因素稍小，需要考慮的是LED和CCD能保持在光路中的確定位置，并具有一定的間距，盡量減少棱鏡中不同部位的反射光對檢測結果的干擾。LED距離a面左端7 mm，線陣CCD中心點距離a面右端27 mm。與TI Spreeta傳感器的棱鏡（1．6 cm×0．9 cm ×1．2 cm ×0．7 cm）相比，本裝置棱鏡尺寸較大，可以增加入射角度范圍（從Spreeta傳感器的4°增加到13°），可檢測樣本種類和濃度變化范圍大大增加。同時，玻璃比TI Spreeta傳感器中的塑料透光性更好，光學性質受溫度影響也更小，其折射率隨溫度變化率（10－6K－1）僅為光學塑料的1/60［6］，因此，可檢測樣品的折射率范圍和穩定性更高。

TI Spreeta傳感器光源采用波長為830 nm的近紅外光LED。已有研究［7］表明，在入射光波段為630～670 nm時，SPR共振峰最尖銳，曲線效果最好，所以，本裝置采用波長為670 nm的紅光LED。TI Spreeta的光電檢測器采用像素點為128的線陣硅光二極管，角度分辨率在0．1°數量級，而本裝置采用的線陣CCD像素點為5000（TCD1501D，日本東芝），角度分辨率在0．01°數量級，檢測精度有顯著提高。同時，高像素點線陣CCD比機械掃描裝置體積更小。由于不同角度的入射光通過2次反射到達CCD檢測面的路徑有所差異，入射角與CCD檢測點的距離變化并不是線性相關的，需要做一些修正:從0像素點開始，每隔100像素點分別計算其對應的入射角度值，直至5 000像素點，然后對這50個入射角度值進行擬合，利用擬合來保證了像素點與入射角度之間對應關系。

光路中除了光源、棱鏡、檢測器，還包括敏感界面和反光鏡這2個反光表面。TI Spreeta直接將金膜鍍在棱鏡表面作為敏感面，金膜使用次數非常有限，如果金膜損壞，必須更換棱鏡。由于光學性能好的棱鏡制作昂貴，這也限制了其廣泛應用。本文中，敏感芯片［8］采用一側鍍有金膜的蓋玻片，通過匹配油粘貼在棱鏡表面。敏感芯片成本低，在損壞后可以直接拋棄。棱鏡頂面安置的反光鏡可以反射入射光束，使光源和光檢測器位于同一平面內，簡化了裝置結構，也減小了體積。反光鏡的反射率高達90%，能夠有效減少光能量的損耗。

1．4 流通模塊

SPR生物傳感分析的待檢測樣品大多是溶液，需要在系統中集成流通模塊來實現樣品的流入、分析和流出。一個完整的流通模塊主要由樣品池、通道和流體驅動機構組成（圖3）。為了保證樣品溶液連續穩定流動，采用TJP—3A/W0109—1B注射泵（中國格蘭）進行液體輸送。注射泵一次注射的容量范圍為 5 μL～60 mL，線性速度范圍為7．94 μm/min～ 79．4 mm/min，可完成灌注、抽取、先灌注后抽取和先抽取后灌注4種傳輸模式，并能夠實現樣品溶液的微量恒流。

為了達到較高的檢測精度，足夠大的敏感界面也同樣重要。檢測系統采用了5 mm×12 mm的敏感界面。六邊形流通池用聚二甲基硅氧烷（poly-dimethylsiloxane，PDMS）加工制成，能夠提高液體流動的穩定性與均勻性［9］。流通池中間區域的面積與敏感界面相當，深度為2 mm，兩端接上細軟管，一端為進樣端，另一端為出樣端。

圖3 流體驅動模塊Fig 3 Fluid driving module

1．5 數據采集模塊

數據采集模塊核心芯片為FX2CY7C68013（CYPRESS公司），該芯片集USB 2．0收發器、串行接口引擎、增強的8051內核、I2C總線接口和通用可編程GPIF于一體，大大提高了數據傳輸速率。它讀入線陣CCD檢測到的光強，進行A/D轉換，然后通過USB總線輸出。行同步脈沖的上升沿對應于CCD有效像元輸出的開始，像元同步脈沖的上升沿則對應于每個像元輸出的有效部分。行同步脈沖周期則是積分時間，積分時間和驅動頻率的設置由接口軟件給出，其采樣頻率最高可達20 MHz。

軟件采用微軟公司的Visual C++6．0開發，主要功能是對數據采集系統進行設置，并對數據進行存儲和顯示。

2 實驗分析

為了測試新研制的SPR傳感檢測系統的線性度和穩定性，利用水、空氣及不同濃度的乙醇溶液進行了共振檢測分析。

2．1 線性度分析

SPR檢測系統的線性度可以通過檢測已知折射率溶液的共振角得出。配制體積分數為2%～20%的乙醇溶液，以2%遞增。對不同體積分數的乙醇溶液進行10次檢測，得到共振角與折射率的關系曲線（圖4）。結果表明:隨著乙醇體積分數的增大，折射率逐漸增大，其共振角也逐漸增大。

圖4 折射率—共振角擬合直線Fig 4 Fitting straight line of refractive index vs resonance angle

通過最小二乘法得到擬合直線方程為:y=135．6x－116．6，相關系數R=0．996 5，表明該SPR檢測儀器具有很高的檢測線性度。

2．2 穩定性分析

穩定性是衡量SPR檢測儀器的另一個重要指標，它可以通過重復測量得到的共振角標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD）來判定。若標準偏差和相對標準偏差值較小，則穩定性較好;反之，亦然。

在相同條件下，分別對空氣和水進行10次重復實驗，結果如表1。

表1 空氣、水共振角及均值、標準偏差、相對標準偏差Tab 1 Resonance angle，standard deviation，relative standard deviation of air and water

結果表明:空氣的SPR共振角為51．993°，標準偏差為0．157°，相 對 標 準 偏 差 為 0．30%;水 的 SPR 共 振 角 為64．042°，標準偏差為0．133°，相對標準偏差為 0．21%?？諝夂退南鄬藴势罹∮?．5%，因此，本系統具有很好穩定性。

3 結論

本文在TI Spreeta傳感器的基礎上，改進了光路結構并集成了流路和檢測系統，形成了一個完整的SPR傳感檢測設備。在光路結構中，改進了棱鏡的外形尺寸和材料，增大了光源入射角度范圍，可以進行更多樣品的SPR檢測。同時，采用波長630 nm的紅光LED，增加了SPR峰的深度，能夠更加準確地確定SPR共振角的位置，提高了檢測精度和靈敏度。采用高像素點線陣CCD，也有助于獲得更高的檢測精度。傳感芯片采用一側鍍有金膜的蓋玻片，大大降低了成本，可以重復使用。在新建立的SPR實驗裝置上利用空氣、水和不同體積分數的乙醇進行了多次傳感檢測分析。實驗研究表明:該裝置不僅能夠對單一樣本進行精確檢測，而且重復性、線性度和穩定性都很好。

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