改進(jìn)熒光法研究氟洛芬與牛血清白蛋白的相互作用

種寶紅，劉保生，李志云，曹世娜

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

1 引 言

目前，在利用熒光法研究藥物與蛋白相互作用方面，廣泛采用的是以牛血清白蛋白(BSA)為檢測(cè)對(duì)象的經(jīng)典熒光法［1-2］，主要利用色氨酸殘基(Trp)的熒光變化信息來(lái)代表BSA 與藥物之間相互作用的整體信息［3］。然而，BSA 是由近600個(gè)氨基酸組成的多肽鏈，其中僅在134 和212 位上有兩個(gè)Trp 殘基。一些藥物分子可能會(huì)與其他的氨基酸殘基結(jié)合，卻由于所結(jié)合氨基酸殘基的熒光太弱或沒(méi)有熒光而無(wú)法表現(xiàn)出來(lái)，此時(shí)經(jīng)典熒光光譜法所表現(xiàn)出來(lái)的信息就是不全面、不準(zhǔn)確的。而藥物的熒光光譜所反映的信息是藥物整體分子的性質(zhì)。因此，以藥物為檢測(cè)對(duì)象，考察體系中BSA 對(duì)其熒光性質(zhì)的影響，就能獲得二者更準(zhǔn)確且更全面的相互作用信息，即本文采用的改進(jìn)熒光光譜法［4］。

氟洛芬為白色或類白色結(jié)晶性粉末，是動(dòng)物專用的廣譜抗生素，主要用于豬、牛、魚(yú)及禽類的治療［5］。為了解氟洛芬在血漿中游離藥物濃度的變化規(guī)律，研究其與血漿蛋白的結(jié)合，本文用經(jīng)典熒光法、改進(jìn)熒光光譜法以及紫外光譜法對(duì)其與BSA 的相互作用機(jī)制進(jìn)行了研究，并將3 種方法所得結(jié)論進(jìn)行比較，對(duì)氟洛芬與BSA 之間的作用方式進(jìn)行了更加準(zhǔn)確的推測(cè)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器包括:島津制作所的RF-5301PC 熒光光度計(jì)及UV-265 紫外光度計(jì)，上海雷磁儀器廠pHS-3C 型精密酸度計(jì)，南通科學(xué)儀器廠CS501型超級(jí)恒溫水浴。

牛血清白蛋白(BSA，純度≥99%，Sigma 公司)配成濃度為1.0 ×10－5mol/L 的水溶液;氟洛芬(Fluprofen)標(biāo)準(zhǔn)品(FF，優(yōu)級(jí)純，純度≥98%)配成1.0 ×10－3mol/L 的水溶液，用時(shí)適當(dāng)稀釋;含0.15 mol/L NaCl 的pH 為7.40 的Tris-HCl 緩沖溶液。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 經(jīng)典熒光光譜法

分別在293，303，310 K 下，于一組10 mL 比色管中分別加入1.0 mL 緩沖溶液、0.3 mL 1.0 ×10－5mol/L 的BSA 溶液、不同體積的FF 溶液，用二次石英蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，靜置30 min。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm、狹縫均為5 nm 時(shí)，記錄340 nm 處的熒光值或熒光光譜。

2.2.2 改進(jìn)熒光光譜法

在4.0 mL 1.0 ×10－4mol/L 的FF 溶液中加入不同體積的1.0 ×10－5mol/L BSA 溶液，在激發(fā)波長(zhǎng)為265 nm 時(shí)，掃描發(fā)射光譜，其他同2.2.1。

2.2.3 紫外吸收光譜法

同2.2.2，以相應(yīng)濃度的BSA 溶液做參比，考察200～350 nm 范圍內(nèi)不同濃度的BSA 對(duì)FF 紫外吸收光譜的影響，記錄225 nm 處的吸光度A。

3 結(jié)果與討論

3.1 FF-BSA 體系的經(jīng)典熒光光譜

以BSA 為檢測(cè)對(duì)象，考察BSA 與FF 之間相互作用的機(jī)理，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可見(jiàn)，隨著FF濃度的增加，BSA 在340 nm 處的熒光強(qiáng)度不斷下降，說(shuō)明FF 猝滅了BSA 的熒光。按Stern-Volmer方程［6］處理所得數(shù)據(jù):

通過(guò)F0/F-［L］圖可得到體系猝滅速率常數(shù)，列于表1。從表1 可知，隨著溫度的升高，Ksv依次減小，由此可推斷該反應(yīng)過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程［7］。且FF-BSA 體系在不同溫度下的Kq值均大于2.0×1010L·mol－1·s－1［8］，進(jìn)一步說(shuō)明FF-BSA 體系的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅。

對(duì)于靜態(tài)熒光猝滅過(guò)程，采用式(2)［9］計(jì)算體系的結(jié)合常數(shù)Ka以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n:

圖1 BSA-FF 體系的熒光光譜(T=298 K，λex=280 nm)。Fig.1 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=280 nm).

表1 不同溫度下FF 與BSA 的猝滅反應(yīng)參數(shù)Table 1 Quenching reactive parameters of FF and BSA at different temperatures

其中［L］為猝滅劑的濃度。以lg ［(F0－F)/F］對(duì)lg［L］作圖，由曲線的截距和斜率即可求得體系的Ka和n，見(jiàn)表1。由表1 可見(jiàn)，隨著溫度的升高，Ka降低，更加證明FF-BSA 體系的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅過(guò)程。

3.2 FF 與BSA 的改進(jìn)熒光光譜

以FF 為檢測(cè)對(duì)象，考察藥物與BSA 的相互作用，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2 可以看到，F(xiàn)F 熒光峰在289 nm 處，隨著B(niǎo)SA 的不斷加入，體系在289 nm處的熒光強(qiáng)度呈加強(qiáng)趨勢(shì)。但這并不是由熒光的敏化增強(qiáng)所導(dǎo)致的，而是因?yàn)镕F 的熒光與BSA的熒光交疊情況嚴(yán)重，F(xiàn)F 的熒光與BSA 熒光產(chǎn)生疊加的結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)以相應(yīng)濃度的BSA溶液作空白以排除干擾。處理后的譜圖如圖3 所示，可以看出隨著B(niǎo)SA 濃度的增加，F(xiàn)F 在289 nm處的熒光強(qiáng)度依次猝滅。按照式(1)、(2)計(jì)算不同溫度下的猝滅參數(shù)，結(jié)果列于表1。

圖2 FF-BSA 體系的熒光光譜(T=298 K，λex=265 nm)。Fig.2 Fluorescence spectra of FF-BSA system (T=298 K，λex=265 nm).

由表1 對(duì)比可知，F(xiàn)F-BSA 體系的Ksv及Ka均隨著溫度的升高而降低，體系發(fā)生了靜態(tài)猝滅，說(shuō)明無(wú)論以BSA 還是藥物FF 為檢測(cè)對(duì)象，得到的蛋白與藥物之間相互作用的機(jī)理是一致的。FF 與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)約為1，而且比傳統(tǒng)熒光法所得到的數(shù)值略大。且相同溫度下，改進(jìn)法得到的結(jié)合常數(shù)均比經(jīng)典法得到的結(jié)合常數(shù)值大，表明BSA 肽鏈中除了位于212 位上的色氨酸殘基外，其他的殘基也同F(xiàn)F 發(fā)生了相互作用。即FF 與BSA 的作用方式除了FF 與212 位色氨酸殘基間“點(diǎn)對(duì)點(diǎn)”的作用方式以外，還有FF 與BSA 疏水區(qū)其他殘基間“點(diǎn)對(duì)面”的作用方式［10］。這說(shuō)明相對(duì)于經(jīng)典法以蛋白為檢測(cè)對(duì)象而言，以藥物為檢測(cè)對(duì)象能夠更全面且更準(zhǔn)確地表達(dá)蛋白與藥物的相互作用信息。

圖3 FF-BSA 體系的熒光光譜(扣除BSA)Fig.3 Fluorescence spectra of FF-BSA system (fluorescence of BSA deducted)

3.3 FF-BSA 體系的紫外光譜

蛋白質(zhì)與藥物的結(jié)合常數(shù)Kb與體系的吸光度值存在以下關(guān)系［11］:

其中A0、A 分別為無(wú)、有猝滅劑時(shí)的吸光度值;［L］為猝滅劑的濃度。以FF 為檢測(cè)對(duì)象，考察藥物與BSA 的相互作用，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4 可知，隨著B(niǎo)SA 濃度的增加，F(xiàn)F 在波長(zhǎng)225 nm 處的吸收峰強(qiáng)度有規(guī)律地減弱并發(fā)生紅移，表明BSA 與FF 發(fā)生了相互作用。根據(jù)式(3)，由(A0－A)－1對(duì)［L］－1作圖計(jì)算體系的Kb，其結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知Kb隨溫度增加而下降，與熒光法得到的結(jié)論相同，Kb值與改進(jìn)法Ka接近，證明了改進(jìn)法的正確性。結(jié)合常數(shù)的差異可能是由熒光法與紫外法方法上的差異所造成的。

圖4 FF-BSA 體系的紫外吸收光譜Fig.4 Absorption spectra of FF-BSA system (T=293 K)

表2 紫外吸收光譜法測(cè)得FF-BSA 體系不同溫度下的結(jié)合常數(shù)Table 2 The binding constants of FF-BSA system by UV absorption spectrometry at different temperatures

3.4 FF 與BSA 之間的作用力類型

生物大分子與藥物間相互作用的熱力學(xué)參數(shù)可以通過(guò)下式計(jì)算［12］:

溫度變化不大時(shí)，可以將反應(yīng)的焓變?chǔ) 看作定值［13］，根據(jù)體系在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K，以RlnK 對(duì)T－1作圖，得出FF-BSA 體系的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。藥物與蛋白之間的結(jié)合能否自發(fā)進(jìn)行取決于體系的ΔG，而焓變的減少或者熵變的增加，都有利于反應(yīng)的自發(fā)進(jìn)行。由表3 可知，利用3 種不同的方法得到該體系的熱力學(xué)參數(shù)均為ΔG＜0，ΔS ＞0，ΔH＜0，表明FF 與BSA 反應(yīng)可以自發(fā)地進(jìn)行，F(xiàn)F 與BSA 之間的相互作用力主要是靜電引力［14］。比較經(jīng)典法與改進(jìn)法及紫外法的ΔG 以及ΔS 的數(shù)值，可知以FF 為檢測(cè)對(duì)象反應(yīng)更容易進(jìn)行。改進(jìn)法和紫外法得到的熱力學(xué)參數(shù)很接近，表明利用改進(jìn)法研究BSA-FF體系的相互作用機(jī)理是準(zhǔn)確的。

表3 不同溫度下FF-BSA 體系的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 The thermodynamic parameters of FF-BSA at different temperatures

3.5 藥物協(xié)同性

Hill 系數(shù)nH能夠用來(lái)定量分析蛋白質(zhì)與配體結(jié)合的協(xié)同性［15-16］:

其中，K 為結(jié)合常數(shù)，Y 為結(jié)合飽和分?jǐn)?shù)。

在熒光實(shí)驗(yàn)中:

在紫外吸收實(shí)驗(yàn)中:

式中，1/Qm為以1/Q 對(duì)1/［L］作圖的截距。再根據(jù)式(6)，以lg［Y/(1－Y)］對(duì)lg［L］作圖，得出FF-BSA 體系的nH值，結(jié)果列于表4。由表4可知，各溫度下的nH均大于1，表明FF 與BSA結(jié)合過(guò)程中，隨著FF 不斷結(jié)合到結(jié)合位點(diǎn)上，后繼配體與BSA 的親和性不斷加強(qiáng)，表現(xiàn)為正協(xié)同效應(yīng)即正協(xié)同性［17］，但其正協(xié)同性較弱。同時(shí)，隨著溫度的升高，體系的nH降低，說(shuō)明溫度升高時(shí)后繼配體與BSA 的親和性降低，這與前面得到的“BSA-FF 體系的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而降低”結(jié)論相一致。3 種方法所得nH值接近，也證明了改進(jìn)法的正確性。

表4 不同溫度下FF-BSA 體系的Hill 系數(shù)Table 4 Hill coefficient of FF-BSA systems at different temperatures

4 結(jié) 論

利用經(jīng)典熒光法以及改進(jìn)熒光法對(duì)藥物FF與BSA 之間的相互作用進(jìn)行了研究，并通過(guò)紫外光譜法對(duì)后者進(jìn)行了驗(yàn)證。通過(guò)比較可知，與經(jīng)典熒光法相比，改進(jìn)法與紫外法所得到的結(jié)合常數(shù)較大，且兩者的數(shù)值接近。這說(shuō)明以藥物為檢測(cè)對(duì)象的改進(jìn)熒光法能夠更全面更準(zhǔn)確地將蛋白與藥物相互作用的信息通過(guò)熒光手段表現(xiàn)出來(lái)。兩種方法的線性擬合方程的線性相關(guān)系數(shù)值均在0.99 以上，雖然改進(jìn)法與紫外法所得出的結(jié)合常數(shù)有一定的差異，但是差異較小，這也說(shuō)明改進(jìn)法是合理的。改進(jìn)熒光法對(duì)一直被人們沿用的經(jīng)典熒光法是一個(gè)挑戰(zhàn)，為能夠更準(zhǔn)確地研究藥物與蛋白之間的相互作用提供了新的途徑，能夠使得蛋白與藥物間的研究得到進(jìn)一步完善。

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