復方丹參片的HPLC特征圖譜研究

寧夏醫學院附屬醫院（750004）馬啟珍

北京市通州區藥品檢驗所（101100）馬啟武△

復方丹參片是由丹參、三七、冰片組成的復方制劑，具有活血化瘀、理氣止痛功效。其有效成分包含脂溶性的蒽醌類成分和水溶性的酚酸類成分。脂溶性蒽醌類成分包括丹參酮I、丹參酮ⅡA、丹參酮ⅡB、隱丹參酮等10余種成分，統稱為丹參酮，其中以丹參酮ⅡA含量較高；水溶性酚酸類成分包括丹參素、原兒茶酸、原兒茶醛和其他酚酸類成分[1][2][3][4]，水溶性成分可能是丹參治療心血管疾病的主要有效成分之一[5]。筆者對市場上流通的不同廠家生產的10批次復方丹參片的甲醇提取液的特征圖譜進行確定并對特征峰進行指認。

1 儀器與試藥

日本島津公司LC-20A高效液相色譜儀（SPD-M20A檢測器）； MettLer XS205天平（十萬分之一）；超聲儀[由天津電子新技術（北京）有限公司提供]；丹參酮ⅡA對照品（批號：110766-200619）、隱丹參酮（批號：110852-2000305）、丹參酮Ⅰ（批號：0867-200205），均由中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇（色譜純），純化水，其他試劑均為分析純。

2 實驗方法[6]

附圖1 丹參酮ⅡA對照品

附圖2 復方丹參片樣品

附圖3 陰性對照品

2.1 色譜條件 色譜柱：WondaSiL C18（150mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-水（73∶27）；檢測波長：270nm；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃，理論塔板數按丹參酮ⅡA色譜峰計不低于2000。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取丹參酮ⅡA對照品10.25mg加入到100mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為儲備液。取儲備液4mL加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得（40μg/mL）。進樣量10μL。

2.3 供試品溶液制備 取本品10片，除去包衣，精密稱定，研細，取約1g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）15min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液置棕色瓶中，即得。進樣量10μL。

2.4 陰性對照品溶液的制備按處方比例，稱取除丹參的其余飲片，按藥典工藝制成顆粒，依上法制成陰性對照品溶液。進樣量10μL。

3 方法學考查

3.1 干擾性試驗 取對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液依法進樣，測定。供試品在與對照品相同的保留時間處有相同色譜峰，而陰性對照品沒有出現，無干擾，見附圖1～3。

3.2 線性范圍考察 取丹參酮ⅡA 對照品儲備液，精密量取2mL、4mL、6mL、8mL，分別加入到10mL的棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，制成20.5μg/mL、41.0μg/mL、61.5μg/mL、82.0μg/mL、102.5μg/mL系列濃度標準溶液，按照上述色譜條件分別進樣測定，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積，以質量濃度（Y）為縱坐標、相應的峰面積（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程為Y＝aX+b，a＝8.6054×10-7，b＝0.0556，R＝0.99999。本次實驗結果表明丹參酮ⅡA在20.5～102.5μg/mL范圍內線性關系良好。

3.3 精密度和溶液的穩定性試驗 取對照品溶液，連續進樣5次，每次10μL，以色譜峰面積計算，測定結果的丹參酮ⅡA的RSD為0.06%，表明精密度良好。取對照品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進樣，每次10μL，共進樣6次，測定峰面積，測定結果的RSD為0.05%，表明丹參酮ⅡA溶液在24h內穩定。

3.4 重復性試驗 取同一批樣品內容物5份，按照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，測定結果丹參酮ⅡA的RSD為1.09%，重復性良好。

3.5 加樣回收試驗 分別稱取6份同一樣品約0.9g（批號：100615），分別精密加入對照品溶液25mL（精密稱取丹參酮ⅡA8.09mg，精密加甲醇200mL，搖勻），按供試品溶液制備方法操作。照上述色譜條件，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算回收率，結果良好，見附表1。

4 特征圖譜的確定及特征峰的指認[7][8][9][10]

4.1 特征峰的指認 按上述色譜條件的方法，取10批樣品內容物各1份，照供試品溶液的制備方法制備，分別精密吸取10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結果見附圖4。根據10批樣品共有峰的情況比較，確定了4個特征峰，用對照品指認了其中的峰2、峰3、峰S分別為隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA。

4.2 特征圖譜測定條件的考察

4.2.1 不同色譜柱的考察 分別用KromSiL、DiamonSiL、WondaSiL 三個品牌（規格同為C185μm，150mm×4.6mm）的色譜柱進行了比較，結果表明各色譜柱出峰順序基本一致，各個色譜柱對各1～4（S）色譜峰分離效果均較好，但其他色譜峰分離度及保留時間均差異較大，故僅確定上述4個峰作為特征峰進行分析。計算特征峰相對保留時間的相對偏差，結果顯示，特征峰1～4（S）RSD均小于3%，結果見附表2，故上述3 個品牌的150mm色譜柱均可用于特征圖譜的測定。

附圖 4 10批復方丹參片色譜圖

附表1 加樣回收試驗

附表2 不同色譜柱相對保留時間

附表3 不同柱溫條件下特征峰的相對保留時間

附表4 10批復方丹參片特征圖譜共有峰相對保留時間

4.2.2 不同柱溫的考察 分別采用不同的柱溫進行了比較，結果表明不同溫度條件下出峰順序基本一致，對1～4（S）色譜峰分離效果均較好。計算特征峰相對保留時間的相對偏差，結果顯示，特征峰1～4（S）RSD均小于2%，故25℃～35℃可用于特征圖譜的測定。結果見附表3。

4.3 樣品的測定 按上述色譜條件的方法，測定10批樣品共有峰保留時間，并以丹參酮ⅡA（S）為參照峰，計算各峰的相對保留時間。結果見附表4。結果顯示，不同批號樣品之間共有峰相對保留時間RSD均小于1%。

4.4 各特征峰相對保留時間規定值的確定 綜合上述不同條件下，以丹參酮ⅡA為參照峰，計算得到的相對保留時間，求取平均值作為規定值，分別為0.44（峰1）、0.60（峰2）、0.70（峰3），并且相對保留時間，均應在規定值的±5%范圍內。

5 討論

復方丹參片作為傳統中藥制劑，充分體現了中藥復方多成分、多靶點的特點，因此對其含有各個成分也應有相應的質量控制。特征圖譜及特征峰作為藥品特別是中藥的質量控制方法，操作簡單，適用性強，可以用于定性和定量檢測。