同種異基因骨髓移植小鼠aGVHD模型的建立

北京市懷柔區(qū)第一醫(yī)院（101400）寧涓

造血干細(xì)胞移植（HSCT）尤其是異基因HSCT（allo-HSCT）現(xiàn)廣泛應(yīng)用于血液腫瘤或非血液惡性腫瘤、再生障礙性貧血、某些遺傳性疾病等的治療，甚至認(rèn)為allo-HSCT是治愈某些血液腫瘤和遺傳性疾病的唯一方法。目前，移植物抗宿主病（GVHD）仍是allo-HSCT移植后相關(guān)死亡的主要原因，是移植的首要障礙，即使在接受HLA配型完全相合的同胞供者移植的患者中，也常發(fā)生嚴(yán)重的急性移植物抗宿主病（aGVHD）而致死。因此，利用動(dòng)物型模來(lái)研究aGVHD的發(fā)病機(jī)理，具有十分重要的理論和實(shí)用價(jià)值。因此，我院利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來(lái)建立一種穩(wěn)定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型，以便更好的研究aGVHD的發(fā)病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ①清潔級(jí)雌性BALB/c（H-2d）小鼠36只，6～8w，18～22g；②清潔級(jí)雄性BALB/c（H-2d）小鼠24只，6～8w，18～22g；③清潔級(jí)雄性C57BL/6（H-2b）小鼠24只，6～8w，18～22g；均購(gòu)自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，并在首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心層流房中飼養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及其配置 含抗生素的飲用水（紅霉素250mg/L，慶大霉素32×104U/L，氟哌酸200mg/L），PBS緩沖液（NaCl 8g、KCl 0.2g、Na2HPO41.44g、KH2PO40.24g溶解后加三蒸水至1L，調(diào)pH 7.2，4℃保存），RPMI-1640培養(yǎng)液（GIBCO公司），紅細(xì)胞裂解液（Tris 2.6g、NH4Cl 7.47g溶于1L三蒸水中，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，調(diào)pH 7.2，4℃保存），PCR引物合成（英駿生物技術(shù)有限公司），普通PCR試劑盒（深圳中晶生物技術(shù)有限公司），瓊脂糖粉（sigma公司），DNA Marker（上海申能博采公司），3S Spin Genomic DNA Miniprep Kit V3.0（上海申能博采公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 普通離心機(jī)：LD-2A型（北京醫(yī)用離心機(jī)廠制造），低溫高速臺(tái)式離心機(jī)（Universal 32，德國(guó)），PTC-0200型PCR儀（美國(guó)），恒溫恒壓電泳儀（國(guó)產(chǎn)），YH-1型超凈工作臺(tái)（廣州），Olympus倒置顯微鏡（Olympus公司，日本），X線直線加速器-231型（VARIAN公司，美國(guó)），凝膠圖像光密度分析儀UVP-GDS型（英國(guó)），紫外分光光度計(jì)GeneQuant Ⅱ（Pharmacia Biotech公司，英國(guó)），200目不銹鋼篩網(wǎng)（廣州），微量加樣器（0.5-1000μL，Eppendorf）。

1.2 方法

1.2.1 受鼠準(zhǔn)備 移植前1w將BALB/c（H-2d）小鼠置于空氣層流房的動(dòng)物飼養(yǎng)空氣層流柜中無(wú)菌飼養(yǎng)，所有墊料、飼料及飲用水均經(jīng)高壓滅菌處理，移植前5d接受含抗生素的飲用水直至移植后2w。

1.2.2 預(yù)處理 移植4h前BALB/c（H-2d）小鼠接受全身照射（TBI），總劑量為8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射源與動(dòng)物之間間隔90cm。

1.2.3 造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞移植

1.2.3.1 供鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離 ①斷頸處死供鼠，75%酒精浸泡5min，在超凈臺(tái)內(nèi)將小鼠腹部向上平放，在腹區(qū)下部皮膚上做一長(zhǎng)橫切口，剝開(kāi)皮膚，露出臀部及后肢。②用鼠齒鑷?yán)o后肢，用剪刀盡可能將肌肉剪開(kāi)，在髖關(guān)節(jié)處將后肢與軀干分離，分離時(shí)勿傷長(zhǎng)骨骨骺，取下的后肢放入有RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。③用剪刀盡可能去除股骨及脛骨表面黏附的肌肉，將脛骨、股骨放入RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中浸泡5min，更換器械，嚴(yán)格無(wú)菌操作；然后剪開(kāi)兩端的骨骺，用1mL注射器針頭刺入骨髓腔中。④用裝有RPMI-1640培養(yǎng)液的注射器反復(fù)沖洗骨髓腔，沖洗液裝入10mL無(wú)菌離心管，用吸管反復(fù)吹打，靜置片刻，去除試管底部沉淀；用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞；之后離心，去除上清液（1500rpm，5min），加RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌1次，再加入RPMI-1640液培養(yǎng)液2mL，反復(fù)吹打使細(xì)胞充分混勻，隨后在顯微鏡下計(jì)數(shù)有核細(xì)胞的數(shù)量，最后用RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為1×108/mL，備用。

附表1 小鼠分組

附表2 各組小鼠平均存活時(shí)間

1.2.3.2 供鼠淋巴細(xì)胞懸液的制備 ①在供鼠腹區(qū)沿腹部中線做一縱切口，打開(kāi)腹腔，取下脾臟（盡量剔除脂肪組織），置于預(yù)先加入5mL RPMI-1640培養(yǎng)液的無(wú)菌平皿中。②在平皿中用注射器針芯在無(wú)菌200目不銹鋼篩網(wǎng)上輕輕研磨脾臟，并用移液管吸取RPMI-1640培養(yǎng)液沖洗不銹鋼篩網(wǎng)，沖洗2遍，移至10mL刻度離心管，以1000rpm（常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)）離心10min，加入5mL預(yù)冷的紅細(xì)胞裂解液，混勻，靜置6min，加入RPMI-1640培養(yǎng)液5mL中止裂解液裂解，1000rpm離心10min，RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌2遍，以RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×108/mL，備用。③將上述兩種細(xì)胞懸液等體積混合，此時(shí)脾細(xì)胞濃度為1.5×108/mL，骨髓細(xì)胞濃度為0.5×108/mL，小鼠移植前4h行X射線全身照射（TBI 8.0Gy，計(jì)量率0.5Gy/min），在無(wú)菌條件下用1mL注射器沿受鼠尾靜脈輸注供鼠骨髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞混合懸液0.2mL，此時(shí)脾細(xì)胞數(shù)為3×107，骨髓細(xì)胞數(shù)為1×107。

1.2.4 小鼠分組及造血干細(xì)胞和淋巴細(xì)胞移植見(jiàn)附表1。

附圖1 各組小鼠肝臟表現(xiàn)

1.2.5 結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.5.1 移植植活狀態(tài)好 體重增加，脾臟見(jiàn)到明顯的脾結(jié)節(jié)，外周血WBC＞1.0×109/L，PCR可檢測(cè)出Y染色體。

1.2.5.2 移植失敗 照射后很快死亡，死亡時(shí)外周血WBC＜0.5×109/L，沒(méi)有嵌合體形成。

1.2.5.3 感染 外周血WBC＞0.5×109/L，外周血見(jiàn)中性粒細(xì)胞核左移，胞漿中有中毒顆粒。

1.2.5.4 aGVHD的判斷標(biāo)準(zhǔn) 外周血WBC＞1.0×109/L，且伴有倦怠，精神萎靡，嗜睡，食欲下降，體重下降，弓背，脫毛，腹瀉，出血；病理檢查可見(jiàn)肝臟、脾臟組織淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，正常組織結(jié)構(gòu)破壞。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，小鼠造血重建時(shí)間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，受鼠生存時(shí)間采用K Independent Samples Test分析。

2 結(jié)果

2.1 造血重建 本研究動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果表明，預(yù)處理后第3d三組受鼠WBC＜1×109/L，且單純照射組WBC始終＜1×109/L，同基因組和異基因組WBC＞1.0×109/L的時(shí)間分別為9.33±2.31d、10.33±1.65d（P＝0.501），兩組造血重建時(shí)間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 小鼠一般狀況和aGVHD觀察 三組小鼠照射后前6d變化類似：體重進(jìn)行性下降，伴活動(dòng)減少，嗜睡，皺毛，弓背但無(wú)腹瀉。A組小鼠于第6d開(kāi)始死亡，死亡高峰在移植后9～12d，第12d全部死亡；B組小鼠第7d起體重逐漸增加，至移植后3w時(shí)體重恢復(fù)正常并繼續(xù)增加，該組小鼠未出現(xiàn)aGVHD的癥狀，全部存活時(shí)間＞60d；C組小鼠第7～10d體重略回升，11d后體重再度開(kāi)始下降，并在11d左右再次出現(xiàn)活動(dòng)減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型GVHD表現(xiàn)[1]，死亡高峰在移植后15～17d，第17d全部死亡，三組小鼠生存時(shí)間存在顯著性差異（P＜0.01）。各組小鼠移植后平均存活時(shí)間見(jiàn)附表2。

2.3 GVHD發(fā)生率 A組、B組小鼠未發(fā)生aGVHD，C組小鼠全部出現(xiàn)aGVHD表現(xiàn)，發(fā)生率100%。

2.4 生存期觀察 經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，A、B、C三組小鼠間的生存時(shí)間存在顯著差異（Log rank＝28.025，P＝0.000）。

2.5 移植后各組小鼠肝臟、脾臟的GVHD相關(guān)病理形態(tài)學(xué)改變 對(duì)各組小鼠的肝臟、脾臟標(biāo)本作常規(guī)病理切片結(jié)果顯示：三組小鼠肝臟、脾臟第3d、第7d未見(jiàn)病變；單純照射組小鼠第12d（瀕死前）肝臟病變：肝臟部分肝細(xì)胞輕度水腫，出現(xiàn)空泡；脾臟髓質(zhì)脾小體明顯消失，大量紅細(xì)胞壞死，含鐵血黃素沉積。同基因骨髓移植組小鼠肝臟第14d病理學(xué)檢查未見(jiàn)異常；脾臟可見(jiàn)脾小體縮小，髓質(zhì)淋巴細(xì)胞未減少，纖維組織增生。異基因骨髓移植組小鼠第14d（發(fā)生aGVHD后3d）肝臟病變：肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，嗜酸性變，匯管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；脾臟髓質(zhì)脾小體消失，脾竇擴(kuò)張、淤血、纖維組織增生，組織細(xì)胞增生典型，見(jiàn)附圖1和2。

2.6 PCR法特異性擴(kuò)增Y染色體進(jìn)行嵌合體檢測(cè) 移植后生存時(shí)間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進(jìn)行PCR法擴(kuò)增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y(jié)染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細(xì)胞植入成功。

3 討論

HSCT廣泛用于惡性與非惡性疾病的治療，尤其是allo-HSCT被認(rèn)為是治愈某些疾病的唯一方法。移植發(fā)展至今，盡管在許多方向獲得極大發(fā)展，但影響allo-HSCT預(yù)后的最主要并發(fā)癥GVHD仍未得到很好解決。同種異體HSCT后GVHD的發(fā)生率高達(dá)50%～80%，并造成30%的移植相關(guān)死亡率，嚴(yán)重影響移植后患者的生存時(shí)間和生存質(zhì)量[2]。因此，需要建立一種穩(wěn)定可靠的GVHD動(dòng)物模型以便更好地研究防治GVHD的方法具有十分重要的意義。鑒于此，筆者利用C57BL/6（H-2b）和BALB/c（H-2d）小鼠來(lái)建立一種穩(wěn)定可靠的同種異基因骨髓移植（BMT）aGVHD模型。

附圖2 各組小鼠脾臟病理特點(diǎn)

GVHD主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，是由供者來(lái)源的T細(xì)胞識(shí)別受者的主要組織相容性和/或次要組織相容性抗原從而被活化，通過(guò)釋放炎癥細(xì)胞因子和直接殺傷作用，損傷受者組織器官的免疫病理過(guò)程[3][4][5][6]。眾多因素與GVHD的發(fā)生有關(guān)，其中移植物中免疫活性細(xì)胞的數(shù)量、供受者之間的組織相容性抗原不合和宿主缺乏對(duì)移植物發(fā)動(dòng)免疫攻擊能力是GVHD發(fā)生的3個(gè)必備條件。在小鼠aGVHD動(dòng)物模型中為滿足上述3個(gè)條件，筆者對(duì)小鼠進(jìn)行骨髓移植前預(yù)處理，移植前4h利用X射線全身照射（total body irradiation，TBI），總劑量8.0Gy，劑量率為0.5Gy/min，照射的目的是清除受者的骨髓造血組織并抑制受者的免疫功能。目前研究認(rèn)為，GVHD的效應(yīng)是供體的活化淋巴細(xì)胞，有文獻(xiàn)報(bào)道當(dāng)移植的脾細(xì)胞＞1×107個(gè)時(shí)，方可造成典型的aGVHD的征象，骨髓細(xì)胞必須＞1×106個(gè)時(shí)方可以保證成功地植入。本研究骨髓細(xì)胞數(shù)和脾細(xì)胞數(shù)分別為1×107和3×107，滿足實(shí)驗(yàn)要求。

本研究中單純照射組小鼠照射后6～12d全部死亡，同基因移植組小鼠全部長(zhǎng)期生存，無(wú)aGVHD征象，實(shí)驗(yàn)組小鼠移植后11d再次出現(xiàn)活動(dòng)減少，嗜睡，弓背，脫毛，腹瀉等典型aGVHD表現(xiàn)；肝臟、脾臟、皮膚病理切片檢查小鼠符合aGVHD征象；aGVHD的發(fā)病率100%。同時(shí)對(duì)同基因移植組和異基因移植組生存時(shí)間＞10d的所有小鼠（BALB/c，♀）進(jìn)行PCR法擴(kuò)增外周血Y染色體檢查，全部均檢查到Y(jié)染色體，提示供鼠（C57BL/6，♂）骨髓細(xì)胞植入成功。筆者成功建立同種異基因骨髓移植模型，且aGVHD表現(xiàn)典型，發(fā)病率100%，從開(kāi)始發(fā)生aGVHD至小鼠全部死亡有7d時(shí)間，為筆者提供充分觀察aGVHD的時(shí)間。

綜上所述，C57BL/6→BALB/C作為MHC不相合異基因移植動(dòng)物模型，具有重復(fù)性好，發(fā)病率高，aGVHD表現(xiàn)典型，可作為aGVHD研究的理想?yún)⒄铡?/p>