靶向人DcR3的microRNA表達載體的構建

周健 何宋兵 宋世鐸 朱東明 李德春 張子祥

·短篇論著·

靶向人DcR3的microRNA表達載體的構建

周健 何宋兵 宋世鐸 朱東明 李德春 張子祥

誘騙受體3(decoy receptor ,DcR3)屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，是一種凋亡抑制蛋白[1]。有研究發現，DcR3基因的表達與人類多種惡性腫瘤的發生、發展及腫瘤免疫逃逸密切相關[2-3]。microRNA(miRNA)干擾技術以其高效、特異的優勢，已經成為一種有效的基因沉默工具。我們前期的實驗研究表明，DcR3基因在人胰腺癌組織和外周血中高表達，并抑制腫瘤細胞凋亡[4]。本研究構建靶向DcR3基因的miRNA表達載體，為胰腺癌的基因治療提供一個新的靶點。

一、材料與方法

1．靶向DcR3的miRNA表達質粒的構建：根據GenBank中DcR3的基因序列(NM_003823)，設計2個靶向DcR3的miRNA。 DcR3-miRNA-1模板包括正義鏈5′-GTCATC-GACTTTGTGGCTTTC-3′，反義鏈5′-GAAAGCCACAAAGTC-GATGACG-3′，loop區5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′；DcR3-miRNA-2模板包括正義鏈5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，反義鏈5′-TACACGCAGTTCTGGAACTAC-3′，loop區5′-AGTGAAGCCACAGATGTA-3′。2個DcR3-miRNA及陰性對照miRNA(shRNA-C)設計及合成均由上海Genechem公司完成。將兩條模板單鏈退火形成雙鏈，插入經Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ雙酶切后形成的線性化質粒載體pP-EGFP-miRNA，形成重組質粒pP-EGFP-DcR3-miRNA-1、pP-EGFP-DcR3-miRNA-2。將連接產物轉化入感受態E.coli TOP10細菌，在含有壯觀霉素的LB瓊脂糖培養基中培養16 h。挑取陽性克隆，小量提取質粒，經Xho Ⅰ和EcoRⅠ雙酶切后電泳分離鑒定質粒，并送上海生工生物技術有限公司測序。測序正確的2個重組質粒分別命名為DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2

2．質粒轉染PANC1細胞：人胰腺癌細胞株PANC1細胞為本實驗室保存，常規培養。取對數生長期的PANC1細胞接種于12孔培養板，每孔1×105細胞，分成空白對照組、陰性質粒對照組、DcR3-miRNA-1組和DcR3-miRNA-2組。培養16 h后采用脂質體Lipofectnmine 2000將相應質粒分別轉染細胞，繼續培養24 h，在熒光顯微鏡下觀察EGFP表達情況。

3．轉染細胞DcR3 mRNA表達的檢測： 采用Trizol提取各組細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA。DcR3探針5′-FAMCTCCTCAGCTCCTGGTACCCTTAMRA-3′，上游引物5′-CTC-TTCCTCCCATGACAC-3′，下游引物5′-CTGGAAAGCCAC-AAAGTC-3′，產物112 bp；內參β-actin探針5′-FAMTTG-AGACCTTCAACACCCCAGCCTAMRA-3′，上游引物5′-CGTGAAAAGATGACCCAGATCA-3′，下游引物5′-CAGCCTGGA-TGGCTACGTACA-3′，產物96 bp。DcR3的定量采用Taq酶探針法，PCR擴增條件：95℃ 10 min，95℃ 15 s、60℃ 1 min，共40個循環，72℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt公式計算mRNA表達量(ΔCt=Ct目的基因-Ctactin,ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt陰性對照)。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線成像、攝影。

4．轉染細胞DcR3蛋白表達的檢測：收集轉染24 h的細胞，提取細胞中的總蛋白，BCA法測蛋白濃度，常規行蛋白質印跡法檢測DcR3蛋白表達。鼠抗人DcR3單抗購自Abcom公司，工作濃度1∶300。最后ECL顯影，凝膠成像系統成像和掃描分析，以GAPDH蛋白作為內參。

二、結果

1．重組質粒鑒定及測序：重組質粒DcR3-miRNA-1和DcR3-miRNA-2雙酶切后經瓊脂糖凝膠電泳顯示約400 bp左右條帶，與預期值416 bp一致。空白對照未見條帶，陰性對照質粒見約1215 bp條帶(圖1)。測序結果表明重組質粒序列與所設計的基因序列完全相符(圖2)。

1：空白對照；2：陰性對照質粒；M：Marker；3～4：DcR3-miRNA-1；5～6：DcR3-miRNA-2

圖1重組質粒的酶切鑒定電泳圖

圖2 重組質粒的測序圖

2．重組質粒轉染PANC1細胞：pP-EGFP質粒帶有綠色熒光蛋白(GFP)，重組質粒轉染PANC1細胞后，陰性質粒對照轉染細胞、重組質粒DcR3-miRNA-1、DcR3-miRNA-2轉染細胞均有綠色熒光蛋白表達，約占細胞總數的80%，空白對照細胞未見綠色熒光(圖3)。

a：空白對照；b：陰性對照質粒；c：DcR3-miRNA-1；d：DcR3-miRNA-2

3． 轉染細胞DcR3 mRNA的表達：2個轉染重組質粒細胞的DcR3 mRNA表達均較轉染陰性對照質粒的細胞及空白對照細胞明顯下降(P﹤0.01)，2個轉染重組質粒細胞的DcR3 mRNA表達的差異無統計學意義(P﹥0.05)。擴增產物電泳后均可在112 bp及96 bp對應位置見清晰的條帶，與預期相符，但轉染重組質粒2組的條帶較淺(圖4)。

4．轉染細胞DcR3蛋白的表達：2個轉染重組質粒細胞的DcR3蛋白表達均較轉染陰性對照質粒的細胞及空白對照細胞明顯下降(P﹤0.05) ，其中轉染DcR3-shRNA-2細胞的抑制效果更明顯，抑制率為76.8%(圖5)。

討論DcR3又稱TR6或M68，是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員，DcR3與腫瘤壞死因子家族中的骨保護素(OPG)、TNFR2、Fas分別具有31%、29%和17%的序列同源性[5]。DcR3具有抑制凋亡和促進腫瘤細胞免疫逃逸的雙重功能，能競爭性結合Fas配體(FasL)、腫瘤壞死因子樣配體1A(TL1A)和T細胞上可誘導表達的、與單純皰疹病毒糖蛋白D競爭結合單純皰疹病毒侵入介體的淋巴毒素類似物(LIGHT)，從而阻斷它們所介導的細胞凋亡[6-8]。此外，DcR3在T細胞和DC細胞的免疫調節方面也發揮著重要的作用[9-10]。在多種人類惡性腫瘤如胃癌、結腸癌、食道癌、肺癌、肝癌中均能檢測出DcR3的高表達[5,11-14]。因此，DcR3可以作為腫瘤基因治療的良好靶點。

與空白對照組和陰性對照組比較，aP<0.01

與空白對照組和陰性對照組比較，aP<0.05

RNA干擾(RNAi)已被證明是一種強大而有效的實驗工具，通過與靶基因結合沉默目的基因的表達。RNAi主要包括兩類，即siRNA和miRNA。miRNA是繼siRNA之后研究較為深入的又一類長20～24 nt的小分子非編碼RNA，它廣泛存在于真核生物中，不具有開放閱讀框架，不編碼蛋白質，具有高度保守性、基因表達時序性和組織特異性[15-16]。miRNA調控靶基因方式有3種：(1)miRNA與目的基因完全互補結合，作用方式及功能與siRNA非常相似，切割和降解mRNA[17]。(2)miRNA與目的基因不完全互補，抑制蛋白質翻譯而不影響mRNA穩定[18]。(3)miRNA誘導目的基因快速脫腺苷化，從而導致mRNA的表達水平下降[19]。因此，miRNA在精準調控基因上可能有著非常重要的作用。

在miRNA的加工過程中，影響Drosha酶剪切的因素為其二級結構，與miRNA一級序列無關，這為通過替換天然的miRNA的靶序列、構建靶向特定靶點的人工miRNA提供重要的理論依據[20]。本研究中我們針對人DcR3的基因序列，設計靶向DcR3的兩條miRNA序列， 5′及3′側翼區來源于miRNA30轉錄本，反向互補的21 nt轉錄后形成靶向mRNA的核心序列，兩端設計的非互補的黏性末端與線性化質粒連接，避免連接方向錯誤等問題，并通過BLAST對其進行特異性分析，確認與人類其他基因無同源序列。使用的干擾載體為pP-EGFP-miR質粒，是特殊設計的表達miRNA并且含有miR側翼的序列，該質粒含有PolⅡ啟動子，是一種人的巨細胞病毒早期啟動子，可高水平表達miRNA，在大多數哺乳動物細胞中表達，并且可以使用組織特異性誘導型啟動子，從而有利于脫靶效應的控制。

本實驗設計并構建了靶向DcR3的miRNA表達載體，經電泳及測序證實載體構建成功，應用Lipofectamine 2000轉染胰腺癌PANC1細胞，通過RT-PCR和蛋白質印跡法驗證針對DcR3的抑制效率，發現兩個重組質粒均能在mRNA和蛋白水平抑制胰腺癌PANC1細胞DcR3的表達，且DcR3-miRNA-2的干擾效果更佳，證實了該質粒可用于靶向DcR3的胰腺癌基因治療的研究。

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2012-11-14)

(本文編輯：呂芳萍)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.02.016

國家自然科學青年科學基金項目(81201905)；江蘇省普通高校研究生科研創新計劃( CXLX11_0088)

215000 蘇州，蘇州大學附屬第一醫院普外科

張子祥，Email：skysuzhou0612@gmail.com