新型混菌發(fā)酵制備丙酸工藝及其優(yōu)化

劉 寅，孫 浩，毛多斌，楊雪鵬，魏東芝

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

作為一類重要的精細化工產(chǎn)品和化工原料，丙酸及其衍生物的用途十分廣泛，可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料等行業(yè)，作為食品添加劑、防腐劑、香料及醫(yī)藥前體使用[1-4]。丙酸生產(chǎn)方法包括化學(xué)合成法和發(fā)酵法。目前，丙酸的工業(yè)化生產(chǎn)是通過化學(xué)合成法來實現(xiàn)的。而微生物發(fā)酵法由于原料可再生、對環(huán)境友好等優(yōu)點越來越受到青睞[1]。

目前，多采用丙酸菌純培養(yǎng)發(fā)酵制備丙酸。但是在丙酸發(fā)酵過程中，丙酸菌的生長易受到產(chǎn)物抑制進而影響丙酸的最終產(chǎn)量。有研究發(fā)現(xiàn)，在瑞士奶酪的制備過程中，丙酸菌與酵母菌會產(chǎn)生相互促進作用，酵母菌可能通過提供維生素、氨基酸或其他因子來促進丙酸菌的生長[5]。因此，通過構(gòu)建混菌發(fā)酵體系，將丙酸菌與酵母菌進行混合培養(yǎng)，促進丙酸菌的生長并提高丙酸產(chǎn)量具有一定的可行性。本文通過比較不同酵母菌與產(chǎn)酸丙酸桿菌的混菌發(fā)酵效果，進而建立混菌發(fā)酵制備丙酸的新工藝，通過優(yōu)化相關(guān)工藝參數(shù)，以期獲得較高的丙酸產(chǎn)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

產(chǎn)酸丙酸桿菌Propionibacterium acidipropioniciCGMCC1.2225 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心；釀酒酵母C1、東方伊薩酵母O1、扣囊腹膜孢酵母F1、異常畢赤酵母A1 由本實驗室分離保藏；丙酸菌種子培養(yǎng)基（g/L） 酵母提取物10.0、胰酶大豆肉湯5.0、K2HPO42.5、KH2PO41.5，pH7.0；酵母菌種子培養(yǎng)基（g/L） 酵母提取物10.0、胰化蛋白胨10.0、葡萄糖20.0，pH7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L） 甘油40，其余成分與丙酸菌種子培養(yǎng)基相同。

Bugbox厭氧工作站 英國Ruskinn公司；Varian 450-GC氣相色譜儀 美國Varian公司；Biostat B plus5 L全自動玻璃發(fā)酵罐 德國貝朗公司；色譜柱 FFAP毛細管柱（25m×0.25mm×0.20μm）。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法 向裝有100mL種子培養(yǎng)基的250mL定制搖瓶中充入純氮氣，丁基橡膠塞密封后115℃滅菌30min，從4℃保藏的液體種子中吸取種子液，以5%的接種量接種至250mL厭氧搖瓶中，30℃，150r/min培養(yǎng)48h。

1.2.2 發(fā)酵過程控制及培養(yǎng)條件 使用貝朗5L全自動玻璃發(fā)酵罐，裝有2L發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌結(jié)束后一邊降溫，一邊通入氮氣（持續(xù)通入數(shù)小時，以保證厭氧環(huán)境）。溫度保持在30℃，攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為150r/min，pH通過自動流加2mol/L NaOH溶液控制在6.50。

1.2.3 混菌發(fā)酵制備丙酸工藝流程

1.2.4 混菌發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.2.4.1 不同酵母菌對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 分別采用扣囊腹膜孢酵母F1（S.fibuligera），東方伊薩酵母O1（I.orientails），異常畢赤酵母A1（P.anomala）和釀酒酵母C1（S.cerevisiae）作為輔助菌與產(chǎn)酸丙酸桿菌按特定接種比例進行同步混菌發(fā)酵產(chǎn)酸實驗。將培養(yǎng)好的各種輔助酵母菌按1%（v/v）接種量，產(chǎn)酸丙酸桿菌按5%（v/v）接種量同時接種于含有2L發(fā)酵培養(yǎng)基的5L發(fā)酵罐中，培養(yǎng)216h。

1.2.4.2 不同初始接種比例對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 P.acidipropionici CGMCC1.2225的接種量保持為5%（v/v），S.cerevisiae種子培養(yǎng)好后，按0、1%、2%、5%（v/v）接種量分別接種，與之相對應(yīng)的混菌接種量比例（產(chǎn)酸丙酸桿菌∶釀酒酵母，v/v）分別為1∶0、5∶1、2.5∶1、1∶1，進行發(fā)酵產(chǎn)酸實驗。

1.2.4.3 不同接種間隔時間對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 將S.cerevisiae厭氧培養(yǎng)一定時間后，再加入P.acidipropionici CGMCC1.2225種子液進行混菌發(fā)酵，接種間隔時間分別為0、4、8、12、24h。在P.acidipropionici CGMCC1.2225的接種量為5%（v/v），S.cerevisiae接種量為2%（v/v）條件下培養(yǎng)。

1.2.4.4 溫度對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 在其他條件不變的情況下，設(shè)定發(fā)酵溫度分別為26、28、30、32、34、36℃，比較不同溫度條件下混菌發(fā)酵情況。

通過這件事，我對她的印象好多了，且不管她說話算不算數(shù)，學(xué)習(xí)總是應(yīng)該的。從那以后，我們都不再荒廢時間了。我雖不相信她能真來，但倘若將來見面了，總不能讓她看低了。

1.2.4.5 中和劑對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 在混菌發(fā)酵實驗中，分別選擇CaCO3（過量添加，添加量為7g/100mL）、氨水（濃度為25%）、NaOH（2mol/L）溶液作為中和劑進行考查。

1.2.4.6 發(fā)酵時間對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 在其他條件不變的情況下，考查不同發(fā)酵時間點（0、8、16、24、36、48、60、72、84、96、120、144、168、192、216、240h）對丙酸累積的影響。

1.2.4.7 發(fā)酵工藝條件的正交優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗的基礎(chǔ)上，選取對丙酸產(chǎn)量具有較大影響的3個因素：發(fā)酵時間（A）、培養(yǎng)溫度（B）、接種比例（C），采用正交表L9（34）進行正交實驗，從而確定最佳發(fā)酵工藝條件。因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表Table 1Factors and levels of L9（34）orthogonal experiment

1.2.5 丙酸測定方法 采用氣相色譜法對發(fā)酵液中的丙酸進行定量[1]。升溫程序：80℃保持1min，以25℃/min升至120℃，0min，以30℃/min升至135℃，0min，以15℃/min升至180℃，保持1min；汽化室溫度：240℃；檢測器溫度：240℃。

1.2.6 丙酸的分離提純 本實驗采取離子交換法進行丙酸的分離提純。離子交換工藝為：發(fā)酵終止后放罐，將發(fā)酵醪液進行滅菌，調(diào)pH至6.5，過濾除去雜質(zhì)，超濾去除蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，濾液經(jīng)過離子交換柱（D301樹脂），NaOH溶液洗脫，加稀鹽酸，蒸餾得到丙酸產(chǎn)品。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 不同酵母菌對混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸的影響 研究發(fā)現(xiàn)酵母菌可能通過提供維生素、氨基酸或其他因子來促進丙酸菌的生長[5]，進而影響丙酸產(chǎn)量。選擇不同種類酵母菌與產(chǎn)酸丙酸桿菌進行混菌發(fā)酵，結(jié)果如圖1所示，當S.cerevisiae C1作為輔助菌時混菌發(fā)酵的丙酸產(chǎn)量最高，達到18.59g/L，與純P.acidipropionici發(fā)酵（對照）相比提高了12.7%；其次是I.orientails O1，丙酸產(chǎn)量為17.30g/L。因此，混菌發(fā)酵時選擇S.cerevisiae C1為輔助菌。

2.1.2 混菌發(fā)酵初始接種比例的優(yōu)化 初始接種比例對混菌發(fā)酵結(jié)果的影響較大[6-7]，可通過微生物種群間的相互關(guān)系影響微生物的組織結(jié)構(gòu)、分布狀態(tài)、在微環(huán)境中的分布密度以及生物群落的生態(tài)平衡等，進而影響代謝產(chǎn)物的合成。結(jié)果如圖2所示，接種比例為Pa∶Sc=2.5∶1時混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸最高，為20.59g/L，與純菌發(fā)酵相比丙酸產(chǎn)量提高了23.2%。丙酸產(chǎn)量的提高可能要歸功于釀酒酵母，當它與產(chǎn)酸丙酸桿菌混菌發(fā)酵時，可縮短發(fā)酵時間，減少維持菌體基本代謝所需的營養(yǎng)及能量，促使更多的底物直接轉(zhuǎn)為產(chǎn)物，從而提高丙酸的產(chǎn)量。因此，確定混菌發(fā)酵初始接種比例為Pa∶Sc=2.5∶1。

2.1.4 混菌發(fā)酵溫度的選擇 微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下完成的，而溫度是保證各種酶生物催化活性的重要因素。因此，在發(fā)酵過程中，保持相對穩(wěn)定而又適宜的溫度是非常必要的。溫度對發(fā)酵的影響主要表現(xiàn)在對菌體生長的影響和產(chǎn)物合成的影響[2，9]。從圖4可知，當發(fā)酵溫度為30℃時混菌發(fā)酵產(chǎn)丙酸水平最高，達21.01g/L。溫度大于32℃后產(chǎn)酸水平下降，說明溫度過高不利于產(chǎn)物累積；另一方面，產(chǎn)酸丙酸桿菌的最適生長溫度為28～30℃。因此，從菌體最適生長和產(chǎn)物最大累積綜合考慮，確定最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2.1.5 中和劑選擇 在發(fā)酵制備丙酸過程中，隨著丙酸量的累積，發(fā)酵液的pH不斷下降。pH過低時會抑制丙酸菌的生長，進而抑制菌體的代謝過程，減少丙酸的合成，故在發(fā)酵過程中需加入中和劑將pH控制在有利于丙酸菌生長和丙酸合成的范圍以內(nèi)[10]。因此，選擇合適的中和劑對丙酸發(fā)酵至關(guān)重要。結(jié)果如表2所示，采用CaCO3和氨水作為中和劑，丙酸產(chǎn)量低，菌體生長受抑制；而采用NaOH（2mol/L）溶液作為中和劑，產(chǎn)酸丙酸桿菌生長良好，丙酸產(chǎn)量最高。因此，混菌發(fā)酵時選取NaOH（2mol/L）溶液為中和劑，采用自動流加方式。

表2 中和劑對產(chǎn)酸和菌種生長的影響Table 2 Effect of neutralizing agent on propionic acid production and bacteria growth

2.1.6 發(fā)酵時間的確定 適宜的發(fā)酵時間對于發(fā)酵過程而言非常主要，時間過短會使得產(chǎn)物濃度較低，時間過長則易造成不必要的浪費。經(jīng)過168h的發(fā)酵，丙酸積累量達到21.90g/L，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，丙酸積累量不增反降，說明靠延長發(fā)酵時間來提高丙酸產(chǎn)量并不可行。同時，考慮到經(jīng)濟效益，本工藝確定混菌發(fā)酵時間為168h。

2.2 發(fā)酵條件正交優(yōu)化

正交實驗結(jié)果見表3，決定丙酸產(chǎn)量的影響因子順序為：培養(yǎng)溫度（B）＞接種比例（C）＞發(fā)酵時間（A）；產(chǎn)丙酸條件的最優(yōu)因子組合為A3B2C2，即發(fā)酵時間為180h，培養(yǎng)溫度為30℃，接種比例為Pa∶Sc=2.5∶1。

為進一步考查發(fā)酵條件的可靠性，進行重復(fù)性實驗，在最優(yōu)發(fā)酵條件下丙酸的平均產(chǎn)量可達24.16g/L，比未優(yōu)化前的結(jié)果提高46.34%。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 The result of orthogonal expweiment

2.3 丙酸的分離提純

從發(fā)酵液中提取丙酸的方法很多，如溶劑萃取法、超濾膜法、蒸餾法、電滲析法等[11]。同上述方法相比較，離子交換法具有一定的優(yōu)越性：a.細胞毒性小，有利于丙酸發(fā)酵與提取的耦合[12]；b.離子交換樹脂可重復(fù)使用，生產(chǎn)成本較低。鑒此，本實驗采取離子交換法進行丙酸的分離提純。按1.2.6中的方法從發(fā)酵液中提取丙酸，純度可達98%以上，純化后的樣品經(jīng)氣相色譜法檢測，結(jié)果見圖6。

3 結(jié)論

為提高丙酸發(fā)酵產(chǎn)量，以產(chǎn)酸丙酸桿菌為菌種，建立混菌發(fā)酵工藝并進行優(yōu)化。通過單因素實驗篩選出最佳輔助菌為釀酒酵母，最佳接種間隔時間為8h，最佳中和劑為NaOH（2mol/L）溶液；選取發(fā)酵時間、培養(yǎng)溫度和接種比例三個因素，設(shè)計三因素三水平正交實驗，確定最佳發(fā)酵工藝條件組合為接種比例Pa∶Sc=2.5∶1，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵時間180h。優(yōu)化后的混菌發(fā)酵工藝能有效提高丙酸產(chǎn)量，丙酸產(chǎn)量達24.16g/L，比未優(yōu)化前的結(jié)果提高46.34%。

[1]Liu Yin，Zhang YG，Zhang RB，et al.Glycerol/glucose cofermentation：one more proficient process to produce propionic acid by Propionibacterium acidipropionici[J].Current Microbiology，2011，62：152-158.

[2]劉寅，張永光，張汝兵，等.響應(yīng)面法優(yōu)化產(chǎn)酸丙酸桿菌丙酸發(fā)酵條件的研究[J].食品工業(yè)科技，2010，31（5）：167-170.

[3]菅秀君，丁文光，胡望月.丙酸的生產(chǎn)工藝及應(yīng)用前景[J].齊魯石油化工，2004，32（1）：32-35.

[4]趙紫華，儀宏，朱文眾，等.丙酸發(fā)酵的研究進展[J].中國食品添加劑，2004（6）：14-18.

[5]Biede SL，Hammond EG.Swiss cheese flavor：II.Organoleptic Analysis[J].Journal of Dairy Science，1979，62：238-248.

[6]王克明.多元混菌固定化發(fā)酵海藻保健酒的研究[J].釀酒科技，2005（10）：75-78.

[7]Viana F，Gil JV，Vall SS，et al.Increasing the levels of 2-phenylethyl acetate in wine through the use of a mixed culture of Hanseniaspora osmophila and Saccharomycescerevisiae[J].International Journal of Food Microbiology，2009，135（1）：68-74.

[8]Grinstead DA，Barefoot SF.Jenseniin G，a heat-stable bacteriocin produced by Propionibacterium jensenii P126[J].Appl Environ Microbiol，1992，58（1）：215-220.

[9]史楠，劉輝，陳寧，等.營養(yǎng)因素及環(huán)境因子對合成L-組氨酸的影響[J].發(fā)酵科技通訊，2006，35（1）：15-17.

[10]Xiaohai Feng，Hong Xu，Jun Yao，et al.Kinetic Analysis and pH-Shift control strategy for propionic acid production with Propionibacterium Freudenreichii CCTCC M207015[J].Applied Biochemistry and Biotechnology，2010，160：343-349.

[11]Rogers P，Chen J-S，Zidwick MJ.The prokaryotes：volume 1：organic acid and solvent production[M].Germany：Springer，2006：511-755.

[12]Gluszcz P，Jamroz T，Sencio B，Ledakowicz S.Equilibrium and dynamic investigations of organic acids adsorption onto ion-exchange resins[J].Bioprocess Biosyst Eng，2004，26：185-190.