牛乳中嗜冷菌檢測方法的研究進展

文 / 龐偉華

（黑龍江立高儀器設備有限公司）

隨著乳品加工業的發展，企業對生奶的需求量逐漸增加，為了防止生奶的變質而廣泛采用冷藏方法來保存生奶。用這種方法保存生奶會導致生奶中嗜冷菌達到一定的數量。嗜冷菌可以抵御極端的寒冷環境，如南極的沿海冰層。嗜冷菌之所以可以在冰點下存活與繁殖，是因為它們有一種特殊的脂類細胞膜。這種細胞膜在化學上可以抵御由極寒帶來的硬化，使得其內蛋白質呈現出“抗凍能力”[1，2]。

嗜冷菌中最常見的品種有耶氏菌、李斯特菌和假單胞菌。人們對嗜冷菌的生長特點研究較少，主要集中在嗜冷菌所產生的酶的作用機制上。影響酶穩定性的因素包括離子數量的增加、結構大小和孔洞數量的減少，特定氨基酸的改變和亞基間疏水作用的增強等[3]。嗜冷菌對熱敏感，一般在UHT滅菌過程中被殺滅，但其代謝產生的酶耐熱，即使在超高溫滅菌140 ℃，5 s仍有殘留（蛋白酶的殘留量為29%，脂肪酶的殘留量為40%)。其中脂解酶大部分和酪蛋白結合，當乳冷卻時從酪蛋白部分轉至脂肪，引起牛乳脂肪水解[4]。研究表明，當生奶中嗜冷菌數量超過1×106CFU/mL時，產生的蛋白酶和脂肪酶將導致超高溫產品發酸，出現脂肪氧化味。根據實際經驗，生產UHT乳制品的生奶，嗜冷菌數需控制在1×103CFU/mL以內[5]。國外早在20世紀80年代，在乳品生產過程中己經建立了完善的嗜冷菌檢測體系。我國在乳品生產過程中，對嗜冷菌的控制還沒有引起足夠的重視。近年來由食品衛生問題而導致的多起消費事件，導致人們對食品的安全性提出了更高的要求，對嗜冷菌的關注度也逐漸提高。

1 嗜冷菌的耐低溫特性

嗜冷菌由于其細胞結構、生物大分子等對低溫有較強的適應能力，因此在低溫下能生長。嗜冷菌細胞膜中脂類含量較多[6]，有助于其在低溫條件下吸收環境中的營養物質。而且其中含有較多不飽和脂肪酸[7]，降低了脂類的溶點。低溫條件下，嗜冷菌可以通過改變細胞外膜蛋白質結構，使通道孔徑縮小，避免有毒物質進入體內。嗜冷菌中二氫脲嘧啶含量高，有助于tRNA局部構象，有較好的柔性以及動力學上較好的流動性，以適應低溫。嗜冷菌所產低溫酶的分子結構一般具有較高的柔性，在低溫條件下能快速進行構象上的調整以適應催化反應的需要，減少能量消耗，進而使嗜冷菌保持正常生長所需的新陳代謝活動[8]。當嗜冷菌所處環境溫度由21 ℃降到5 ℃時，細胞內可產生26 種冷休克蛋白。冷休克蛋白的作用可能是通過與DNA和RNA相互作用來促進一些嗜冷菌在低溫條件下生長所需蛋白質的合成[9]。

2 嗜冷菌對原料奶的危害分析

嗜冷菌主要來源于外源性污染，如牛體、奶站環境、擠奶器具、冷藏奶及運奶的器具、工作人員的衛生狀況等，管理對嗜冷菌的控制有較大影響。原料奶中以兼性嗜冷菌為主，目前從原料奶中分離到的嗜冷菌有假單胞菌屬、產堿桿菌屬、無色桿屬、黃桿菌屬和克雷伯氏桿菌屬等[10]。對這些菌株進行特性分析后發現，它們都會對原料奶的保存產生危害。如假單胞菌，具有強力分解脂肪和蛋白質的能力，可使脂肪分解從而產生脂肪哈敗味，可將原料奶中的蛋白質分解成蛋白胨；產堿桿菌，其本身不能分解原料奶中的糖類產酸，但其能產生灰黃色、棕黃色的色素，并可使原料奶中所含的有機鹽分解而形成碳酸鹽，從而使原料奶轉變為堿性，并能導致乳制品產生粘性變質。總之，嗜冷菌能破壞原料奶中的成分，主要是由于嗜冷菌可以產生使脂肪、蛋白質分解的耐熱脂肪酶、蛋白酶[11]。另外，嗜冷菌在有氧低溫下可進行生色反應，如黃色、綠色、奶油色、金色、紅色、棕褐色和黑色等。在原料奶運輸和儲存過程中，攪拌和長時間搖晃能使嗜冷菌生長速度加快，所以在制冷運輸過程中應該盡量避免長時間攪拌和反復入罐；在條件允許的情況下，盡量將牛奶的制冷溫度調整至2 ℃儲存，將牛奶運輸到廠的溫度控制在4 ℃以下。這樣可以有效控制嗜冷菌的繁殖，提高原料奶質量；同時，盡量縮短原料奶的儲存時間，在現有條件下將24 h到廠時間縮減至16 h左右，也是控制嗜冷菌繁殖的有效手段。

3 嗜冷菌對UHT奶的危害分析

嗜冷菌產生的熱穩定性胞外降解性酶類在巴氏殺菌過程中基本不受影響，經過UHT處理后仍能保持部分活性，導致UHT乳蛋白凝塊和乳清析出。隨著UHT乳貯存時間延長，首先會出現少量小凝塊，然后逐漸增大并沉于底部，而上部則析出少量的乳清液。這主要是酶水解乳蛋白引起的，主要水解κ-CN生成副-κ-CN，從而失去了κ-CN對蛋白質的穩定作用，使蛋白質聚集，最終由于自身重力作用沉于底部，隨時間的延長，并逐漸析出乳清[12]，同時產品發苦，在水解過程中釋放的氨基酸會使褐變反應加劇。脂肪酶分解原料奶中的脂肪球，產生游離的短鏈脂肪酸使原料奶酸度升高導致腐敗，由于游離脂肪酸的增加，導致脂肪上浮，乳制品風味變差，產生乳酪味、腐爛味、肥皂味、不潔味或酵母味等[13]。這些由嗜冷菌產生的脂肪酶、蛋白酶還會造成片式熱交換器的淤塞，使清洗困難。

4 國內外嗜冷菌檢測方法研究現狀

由于原料奶中嗜冷菌對高溫殺菌的乳制品影響較大，因此對于原料奶中嗜冷菌的檢驗是非常重要的。IDF Standard 101A中嗜冷菌數的檢測方法為：將原料奶在5~7 ℃培養10 天后計數；IDF Standard 132A中嗜冷菌數的檢測方法為：將樣品在21 ℃下增菌培養后，采用選擇性培養基在21 ℃培養25 h后，將樣品中革蘭氏陰性桿菌作為嗜冷菌污染的指標。但這些方法所需的檢測時間長，因此對原料奶的收購沒有指導性意義。因此，國外研究者不斷對嗜冷菌的檢測方法進行研究和改進，以期得到既快速又準確，而且適合工業化應用的檢測方法。

4.1 PCR-ELISA法

Gutiérrez等在20世紀90年代將PCR技術和ELISA技術結合用于測定冷藏牛奶中細菌的數量。他們找出了一個廣泛存在于冷藏原料奶中的微生物中的DNA片段。實驗表明，當細菌數在103～107CFU/mL時，PCR-ELISA檢測方法中樣品的DNA擴增吸光度效果最好，而且在測定4 ℃下保存的原料奶中嗜冷菌的數量時，與傳統的標準平板計數培養法之間存在很高的相關系數（r=0.94，p＜0.001）[14]。PCRELISA方法最突出的優勢在于節省時間，該方法檢測全部樣品需要的時間為24 h。PCR-ELISA方法具有很高的特異性和敏感度。Sharpe等[15]和Fung等[16]認為PCR-ELISA這種基于免疫學和基因技術的方法提供了一種互補的、創新的途徑來檢測食品中的微生物，不但減少了分析的時間，而且仍然可以保持高的可靠性和敏感度。

4.2 氧化還原法

用選擇性試劑二氯甲基苯翁和細菌指示劑四唑鹽混合在一起在30 ℃培養，四唑鹽會被還原，使樣品奶的顏色變成紅色。變色需要的時間決定樣品奶中低溫菌的數量與存在的活性[17]。

4.3 酶聯免疫吸附技術

此方法是基于酶反應的一種高特異性和高靈敏性的檢測方法，它可以從復雜的樣品體系中特異地與目標反應物結合，從而達到檢出的目的。Rosalba等利用單克隆抗體和間接ELISA的方法測定了冷藏奶中的嗜冷菌，并且與嗜冷菌的平板計數法進行比較。實驗結果表明，測定4 ℃下保存的成品奶樣品中嗜冷菌，平板計數法和ELISA方法之間存在非常好的相關系數[18]。

4.4 氨肽酶法

Susana等測定了冷藏原料奶的微生物。他們用無色L-丙氨酸-p-對硝基苯胺作為底物，通過嗜冷菌細胞壁的氨肽酶的作用使其裂解成p-硝基苯胺（黃色），最后用紫外分光光度計測定吸光度，間接反映樣品中嗜冷菌的數量。實驗結果表明，氨肽酶法和傳統的微生物計數方法之間存在很高的相關性，所需的檢測時間約為2.5 h，儀器和實驗操作簡單[19]。

4.5 脂肪酶活性的測定

任靜等研究出了一種新的檢測方法。方法的原理為：嗜冷菌能在奶中產生大量耐熱性脂肪酶，在脂肪酶和嗜冷菌之間建立一種線性關系，利用4-硝基苯酚游離釋放法測定脂肪酶的活力，從而間接反映嗜冷菌的數量。實驗結果表明，總菌數和酶活之間存在的線性關系極顯著[20]。

5 結語

為了生產高質量的乳制品，原料奶中的嗜冷菌的檢驗是尤為重要的。開發快速、準確、操作簡單、價格低廉的嗜冷菌檢驗方法是未來乳品企業重點研究的課題之一。檢驗方法的開發是保證產品質量的關鍵，但是卻增加了生產成本，并且具有滯后性，而且不能指導高質量原料奶的生產和加工，因此，對于原料奶的早期生產控制更是乳品行業最需要考慮的問題。

[1] Yoshinori M，Takayuki H，Emiko K，et al. Genome-wide expression analysis of yeast response during exposure to 4℃.Extremophiles，2006（10）：117–128.

[2] Jill A M，Ann P，David T J，et al. A contemporary microbially maintained subglacial ferrous “Ocean”. Science，2009（2）：324-397.

[3] David C D，Francisco M V，Constance S C.Enzymes from extremophiles. Current Opinion.Chemical Biology，2001（5）：144-151.

[4] 付建平，靳燁，馬玉玲. 乳中蛋白酶與UHT乳貯存中的膠凝現象. 中國乳品工業，2004， 32（7）：22-25.

[5] 吳榮榮，王倩，王敏，等. 原料乳中嗜冷菌的危害分析及控制研究. 中國釀造，2008（19）：13-16.

[6] Ratledge C，Wilkinson S G. Microbial Lipids（Volume 1）. London：Academic Press，1988.

[7] Harwood J L，Russell N J. Lipids in plants and microbes. In：George A U, Ring E, Sinclair P D，Birkbeck H，Barbour A. Production of eicosapentaenic acid by vibrio pelagius isolated form turbot（Scophalmus maximus L）larvae.Appl Environ Microbiol，1992（58）： 3777-3778.

[8] Nakajima M，Mizusawa K，Yoshida F.Purification and properties of an extracellular proteninase of psychrophilic Escherichiafreundii.Eur J Biochem，1974（44）：87-96.

[9] Jones P G，Inouye M. The cold-shock response-a hot topic. Mol Mocrobiol，1994（11）：811-818.

[10] Cousinma. Presence and activity of Psychrotrophic microorganisms in milk and dairy products：a review. Food Prot，1982（45）：172-207.

[11] 蘇景輝，于敏艷，孟凡玉. 嗜冷菌對原料奶質量的影響及控制方法. 食品與發酵科技，2011，4（31）：100-102.

[12] Datta N，Deeth H C. Age gelation of UHT milk transactions of the institute of chemical engineers C. Food and Bioproducts Processing，2001（79）：197-210.

[13] 林元壁. 影響超高溫滅菌乳在貯藏期中游離脂肪酸含量變化的因素研究. 中國乳品工業，1994，10（22）：206.

[14] Gutierrez R，Garcia T，Gonzalez I，et al. A quantitative PCR-ELISA for the rapid enumeration of bacteria in refrigerated raw milk.Journal of Applied Microbiology，1997，83（4）：518-523.

[15] Sharpe A N. Developments in rapid methods for detection of agents of foodborne disease.Food Research International，1994，27（3）：237-243.

[16] Fung D Y C. What’s needed in rapid detection of foodborn pathogens. Food Technology， 1995，49（6）：64-67.

[17] 李艷霞，劉會平. 嗜冷菌對UHT乳的影響及預防措施. 食品科技，2008（9）：59-61.

[18] Gutierrez R，Gonzalez I，Garcia I，et al.Monoclonal anti-bodies and anIndirect ELISA for detection of psychrotrophic bacteria in refrigerated milk. Journal of Food Protection，1997，60（1）：23-27.

[19] Manzan S，Ordonez J A，DE L L，et al. A rapid method for the estimation of the microbiological quality of refrigerated raw milk based on the aminopeptidase activity of gramnegative bacteria. International Dairy Journal，2005，15（1)：79-84.

[20] 任靜，張蘭威. 原料乳中嗜冷菌的檢測. 食品工業科技，2007（3）：217-220.