小檗堿逆轉高糖對血管內皮細胞遷移的抑制作用

李必強，林 威，姚恩輝，林 楠，黃培基

高血糖的內環境可導致血管內皮細胞的功能紊亂，是糖尿病患者血管病變的主要原因之一［1］。流行病學的研究顯示，糖尿病與心血管病變的危險性增加密切相關，糖尿病患者較一般患者心肌梗死后所需的恢復時間更長，出現梗死后心絞痛、梗死面積擴大和充血性心力衰竭的風險更大［2］，其原因為糖尿病患者的冠狀動脈側支循環的建立相對減弱，其中，高血糖對內皮細胞功能的負面影響是導致該病理狀態的重要因素［3］。

小檗堿又名黃連素，是由中藥毛莨科植物黃連的干燥根狀莖中提取的一種異喹啉生物堿，已證實可用于代謝綜合征相關心血管疾患的治療［4］。有報道表明，小檗堿可降低高血糖對內皮細胞的損傷，但其具體作用機制尚未得到全面闡明。本研究采用體外培養的永生化的人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）EA.hy926細胞為模型，研究小檗堿對高血糖環境下內皮細胞遷移的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 鹽酸小檗堿、D－葡萄糖及 MTT（四甲基偶氮唑藍）及二甲基亞砜（DMSO）（上海生工生物工程有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程有限公司），DMEM低糖及高糖培養基（美國Gibco公司，低糖培養基為EA.hy926細胞常規培養使用的含5.6mmol／L D－葡萄糖的DMEM 培養基，高糖培養基為含33mmol／L D－葡萄糖的DMEM培養基）；Non－radioactive EMSA of NF－κB檢測試劑盒（TFDET001，美國Viagene公司）。

1.2 方法

1.2.1 血管內皮細胞的培養 HUVEC EA.hy926（中科院上海細胞庫）解凍復蘇后，培養于含10%胎牛血清的DMEM低糖培養基，置于37℃、體積分數為0.05的CO2培養箱中。血管內皮細胞呈梭形，融合生長時呈多角形單層鋪路石樣形態排列；當細胞融合生長至80%左右，采用0.25%的胰蛋白酶消化，2～5代以內的細胞用于實驗。

1.2.2 樣品配制 鹽酸小檗堿溶于DMSO，凍存于－20℃保存，臨用前以培養液稀釋到相應終濃度，DMSO含量為0.5%。實驗分4組：D－葡萄糖5.6mmol／L組，即低糖培養組，采用5.6mmol／L的葡萄糖培養基培養EA.hy926細胞；D－葡萄糖33mmol／L組，即高糖培養組，采用33mmol／L的葡萄糖培養基培養EA.hy926細胞；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 堿 2.5 μmol／L 組，即 經 過2.5μmol／L的小檗堿處理過的高糖培養組；D－葡萄糖33mmol／L＋ 小 檗 堿 5μmol／L 組，即 經 過5μmol／L的小檗堿處理過的高糖培養組。

1.2.3 細胞活性測定 將正常生長的內皮細胞胰酶消化稀釋后按每孔5×103個接種于96孔板，培養24h后，更換為相應的樣品培養液，繼續培養48h后，加入 MTT溶液（5mg／mL），每孔10μL，孵育4h，棄培養液，DMSO溶解，酶標儀（570nm）測定吸光度。

1.2.4 劃痕試驗 參照文獻［5］，將EA.hy926細胞培養于24孔板，待細胞生長融合至80%左右時，用200μL微量加樣器頭在培養板中輕劃直線，寬約0.5mm，形成無細胞的裸露區域，采用PBS清洗培養板，將懸浮細胞清除；更換為含2%血清培養基的相應供試溶液，連續觀察8h（2%的血清可加速細胞遷移速度，對細胞的增殖作用可忽略不計）。在低倍鏡下計數原裸露區域中內皮細胞的遷入數量，用遷入數量與裸露區的面積比值表示細胞遷移率。

1.2.5 核因子－κB（NF－κB）活性測定 電泳遷移率改 變 法 （electrophoretic mobility shift assay，EMSA）測定NF－κB結合活性。以化學發光法檢測NF－κB的DNA結合活性，嚴格按說明書的要求完成相關實驗步驟。采用ImageJ 1.47V圖像分析軟件計算光密度值。

1.3 統計學處理 數據以±s表示。采用 Microsoft Office Excel 2003軟件t檢驗進行數據分析。每次試驗相同條件平行處理3～6個樣本，重復3次。

2 結 果

2.1 高糖對細胞活性的影響 采用含不同濃度D－葡萄糖的DMEM培養液培養48h后，MTT法檢測細胞活性，實驗結果顯示，2種條件下對EA.hy926細胞的增殖活性并無明顯的影響，高糖培養組細胞增殖活性僅略低于低糖培養組，2組差別無統計學意義。

2.2 小檗堿對 EA.hy9 2 6細胞活性的影響10～40μmol／L小檗堿可抑制EA.hy926細胞的增殖，且作用強度與劑量有關，但低于5μmol／L則抑制作用不明顯。

2.3 小檗堿逆轉高糖對內皮細胞遷移的抑制作用相對于低糖培養基，33mmol／L高糖處理6h后，細胞的遷移率明顯降低（P＜0.05），表明高糖培養基可抑制內皮細胞的遷移。然而，采用2.5及5μmol／L小檗堿同時處理后，細胞的遷移率得到一定程度的恢復，表明小檗堿可以逆轉高糖培養基對內皮細胞遷移的抑制作用（表1，圖1）。

表1 小檗堿對高糖所致EA.hy926細胞遷移抑制作用及NF－κB DNA的結合活性的影響Tab1 Impact of berberine on the migration and NF－κB DNA binding activity in high－glucose treated EA.hy926cells

圖1 小檗堿對高糖所致EA.hy926細胞遷移抑制作用的影響（ ×100）Fig1 Impact of berberine on the migration of high－glucose treated EA.hy926cells（ ×100）

2.4 小檗堿抑制高糖誘導的NF－κB活性上調 不同處理條件6h后的EA.hy926細胞NF－κB DNA結合活性的相關實驗結果顯示，相對于低糖培養基，33mmol／L高糖處理6h后，NF－κB DNA 的結合活性明顯增強；然而，采用2.5及5μmol／L小檗堿同時處理后NF－κB DNA的結合活性受到一定程度的抑制，且作用強度與劑量有關（P＜0.01），表明小檗堿逆轉高糖培養基對內皮細胞遷移的抑制作用可能與抑制高糖誘導NF－κB DNA的結合活性升高有關（表1，圖2）。

圖2 小檗堿對 EA.hy926細胞 NF－κB DNA 的結合活性的影響Fig2 Impact of berberine on NF－κB DNA binding activity in EA.hy926cells

3 討 論

研究證實，糖尿病患者的心血管相關疾病的死亡風險遠高于非糖尿病患者［6－7］。糖尿病患者發生冠狀動脈病變后，死亡率明顯增加，并且更易出現心肌梗死的延展及充血性心力衰竭。有研究表明，合并糖尿病的冠心病患者側支循環產生的數量明顯少于非糖尿病患者，提示高血糖是冠狀動脈側支循環形成的抑制因素［3］。因此，逆轉高血糖對冠狀動脈側支循環形成的影響具有重要的臨床價值。

血管內皮細胞是覆蓋在血管內表面高度分化的單層細胞，是構成血管的重要組成部分，血管內皮細胞的遷移是冠狀動脈側支形成的重要步驟之一［8］。有研究表明，高血糖可抑制HUVEC以及人主動脈內皮細胞（HAEC）的遷移、增殖及血管發生過程［1，9］。本研究采用永生化的 HUVEC EA.hy926研究高糖對內皮細胞遷移的影響，實驗結果表明，在33mmol／L D－葡萄糖存在的條件下，相對于5.5mmol／L D－葡萄糖培養條件，EA.hy926的遷移受到明顯抑制，該結果與相關的文獻報道一致，說明高血糖確為新生血管形成的抑制因素。與以往的報道不同，筆者的實驗結果表明，不同濃度D－葡萄糖對EA.hy926活性的影響不大，推測可能與不同來源的細胞株及傳代培養條件有關，也說明高糖對內皮細胞活性的影響可能并不是糖尿病類心血管疾病發生的主要原因，與相關文獻報道一致。

近年來，有關小檗堿的藥理活性研究得到進一步擴展，國內外大量的科研證實小檗堿具有抗腫瘤及抗糖尿病作用［10－11］。有關小檗堿降血糖的作用機制已有較多報道，主要集中在降血糖作用及調節脂代謝作用方面，也有少數研究關注小檗堿對內皮細胞的保護作用，認為小檗堿可以通過NO通路等途徑改善內皮細胞功能［12］，但是否能影響內皮細胞的遷移尚未見相關報道。在本研究中，筆者采用不同劑量（2.5，5μmol／L，該濃度條件對 EA.hy926細胞活性沒有明顯的影響）的小檗堿處理高糖環境下的EA.hy926細胞，實驗結果表明，小檗堿可以逆轉高糖對血管內皮細胞遷移的抑制作用，且作用強度與劑量有關，表明該作用可能也是小檗堿防治糖尿病性心血管疾病的作用機制之一。

有關小檗堿逆轉高糖對血管內皮細胞遷移抑制作用的作用機制研究是基于如下考慮：首先，已有報道指出，NF－κB的激活是高糖抑制內皮細胞遷移的主要因素［9］，此外有研究表明，小檗堿可抑制NF－κB的激活，從而發揮抗炎及抗腫瘤作用［13］；在此基礎上，也有研究認為小檗堿通過抑制NF－κB的激活達到對抗高糖對血管內皮細胞的損傷［14］；故推測抑制NF－κB活性可能介導了小檗堿逆轉高糖對血管內皮細胞遷移的抑制作用。本研究證實，在體外培養的EA.hy926細胞模型水平，小檗堿可抑制高糖誘導的NF－κB激活，且作用強度與劑量有關，說明小檗堿逆轉高糖對血管內皮細胞遷移的抑制作用的作用機制與抑制NF－κB激活密切相關。

綜上所述，本研究表明小檗堿可通過抑制NF－κB活性上調逆轉高糖對內皮細胞遷移的抑制作用。因此小檗堿不僅可以降低血糖，而且可能通過保護血管內皮的正常生理功能從而達到預防和治療高血糖相關心血管類疾患的作用；此外，本研究提示以小檗堿為先導化合物開發新型血管內皮細胞保護劑亦具有一定的科研價值。

［1］Yu P，Yu D M，Qi J C，etal.High D－glucose alters PI3Kand Akt signaling and leads to endothelial cell migration，proliferation and angiogenesis dysfunction［J］.NatlMedJChina，2006，86（48）：3425－3430.

［2］Rocic P.Why is coronary collateral growth impaired in typeⅡdiabetes and the metabolic syndrome［J］.VasculPharmacol，2012，57（5－6）：179－186.

［3］Yong Y，Liang M，Gui Q J，etal.The Effects of diabetes mellitus on coronary collateral circulation and correlation with serum asymmetric dimethylarginine［J］.JournalofNanhua University：MedicalEdition，2012，40（1）：73－75.

［4］Lin J，Feng R E，Lv J H，etal.The effects of berberine on inhibiting glycation－oxidative stress and down－regulating inflammatory cytokines in metabolic syndrome and hypertensive rats with ventricular remodeling［J］.PharmacologyandClinicsofChineseMateriaMedica，2011，27（6）：15－19.

［5］Lai Y，Shen Y，Liu X H，etal.Interleukin－8induces the endothelial cell migration through the activation of phosphoinositide 3－kinase－Rac1／RhoA pathway［J］.IntJBiolSci，2011，7（6）：782－791.

［6］Giorgino F，Leonardini A，Laviola L.Cardiovascular disease and glycemic control in type 2diabetes：now that the dust is settling from large clinical trials［J］.AnnNYAcadSci，2013，1281（4）：36－50.

［7］Chen B，Guo W，Chen S Q.Evaluation of left ventricular systolic synchronization of patients with type 2diabetes mellitus by omni－directional M－mode echocardiography［J］.Journalof FujianMedicalUniversity，2011，45（5）：363－366.

［8］Sprague E A，Tio F，Ahmed S H，etal.Impact of parallel micro－engineered stent grooves on endothelial cell migration，proliferation，and function：aninvivocorrelation study of the healing response in the coronary swine model［J］.CircCardio－vascInterv，2012，5（4）：499－507.

［9］Hamuro M，Polan J，Natarajan M，etal.High glucose induced nuclear factor kappa B mediated inhibition of endothelial cell migration［J］.Atherosclerosis，2002，162（2）：277－287.

［10］Lin J，Qi H，Zhuang Q K，etal.Effect of berberine derivate B－119on inhibition of tumor and vascular endothelial cell proliferation［J］.JournalofFujianMedicalUniversity，2012，46（2）：95－99.

［11］Yin J，Xing H，Ye J.Efficacy of berberine in patients with type 2diabetes mellitus［J］.Metabolism，2008，57（5）：712－717.

［12］Wang C，Li J，Lv X，etal.Ameliorative effect of berberine on endothelial dysfunction in diabetic rats induced by high－fat diet and streptozotocin［J］.EurJPharmacol，2009，620（1－3）：131－137.

［13］Pandey M K，Sung B，Kunnumakkara A B，etal.Berberine modifies cysteine 179of IkappaBalpha kinase，suppresses nuclear factor－kappaB－regulated antiapoptotic gene products，and potentiates apoptosis［J］.CancerRes，2008，68（13）：5370－5379.

［14］Wang Y，Huang Y，Lam K S，etal.Berberine prevents hyperglycemia－induced endothelial injury and enhances vasodilatation via adenosine monophosphate－activated protein kinase and endothelial nitric oxide synthase［J］.CardiovascRes，2009，82（3）：484－492.