擬反相液相色譜法快速測定奶茶中咖啡因含量的研究

董麗麗，于 玲，李 敏，王力川

(邢臺學(xué)院 生物化學(xué)系，河北 邢臺 054001)

奶茶兼具牛奶和茶的雙重營養(yǎng)，由于美味可口、時尚休閑、方便快捷，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，尤其是以青少年消費(fèi)群體為主。近年來，國內(nèi)奶茶市場正處在快速發(fā)展階段，多種品牌及不同口味的奶茶層出不窮。奶茶中含有生物堿、多種維生素、單寧酸、芳香油等300多種對人體有益的化學(xué)成份。咖啡因是奶茶中的重要生物堿，具有解除疲勞、興奮神經(jīng)、促進(jìn)血液循環(huán)等作用，但大劑量或長期使用會損害人體健康，有成癮性，被列入受國家管制的精神藥品范圍。因此對食品中咖啡因的含量檢測是非常必要的。在咖啡因檢測中，最常見的是咖啡、茶、軟飲料中咖啡因的測定［1－10］，對奶茶中咖啡因的檢測則相對較少。擬反相色譜法［11］是以正相色譜所用的極性色譜柱為固定相，配以反相色譜的含水溶劑為流動相的色譜方法。相比于反相色譜和親水作用色譜，擬反相色譜的研究極少，已有報道主要是對保留行為的探討［12－16］，而利用擬反相色譜進(jìn)行檢測的文獻(xiàn)并不多。本實(shí)驗將擬反相液相色譜法用于奶茶中咖啡因含量的測定，建立的方法所需有機(jī)相含量極低(僅占5%)，且分析速度快(5 min內(nèi)可完成樣品的分離測定)，極大地減少了有機(jī)試劑的耗費(fèi)，同時也減少了對環(huán)境的污染。本研究是對食品中咖啡因檢測方法的補(bǔ)充，可用于樣品的日常測定，同時也可以促進(jìn)色譜機(jī)理的進(jìn)一步探討。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器條件與試劑

HPLC條件:島津LC－20AT高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器;色譜柱為InertsilHPLC Col-umn 100－5SIL(150mm×4.6mmi.d.5μm);流動相為0.03mol·L－1甲酸鈉溶液(pH 2.9)－乙腈(95∶5)，流速1.0mL·min－1，進(jìn)樣量10μL。檢測波長274 nm。

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品由茶葉提取，升華提純。取適量溶于甲醇制備成5.133 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，使用時用流動相稀釋至所需濃度。

12種不同品牌、不同口味及包裝(袋裝或杯裝)的奶茶均購自當(dāng)?shù)匾患掖笮统小?/p>

乙腈、甲醇、異丙醇均為色譜純，其他試劑為分析純，實(shí)驗用水為超純水。

1.2 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取各種奶茶約1 g，用適量85℃的水溶解后，用水定容至100 mL。移取10 mL離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，吸取10 μL進(jìn)樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 有機(jī)溶劑類型的選擇 本文采用擬反相色譜法測定咖啡因。首先考察了流動相中有機(jī)溶劑類型對咖啡因保留的影響。保持其它條件相同，分別以甲醇、異丙醇、乙腈3種有機(jī)溶劑與甲酸鈉緩沖液(0.03 mol·L－1，pH 2.9)(5 ∶95)組成流動相，所得色譜圖見圖1。3種有機(jī)溶劑對溶質(zhì)的洗脫強(qiáng)度按以下順序遞增:甲醇＜異丙醇＜乙腈。

圖1 有機(jī)溶劑類型對咖啡因保留的影響Fig.1 Influence of organic modifier on the retention of caffeine A.acetonitrile;B.isopropanol;C.methanol

由于甲醇是質(zhì)子化溶劑，具有強(qiáng)的氫鍵作用能力，在硅膠表面可與水競爭吸附，流動相中的甲醇一部分吸附在固定相表面代替水分子。該條件下，流動相中甲醇的含量很低(只占5%)，此時會更低。而溶質(zhì)的保留對流動相中有機(jī)相的含量極為敏感［12］。因此甲醇含量的輕微變化可導(dǎo)致溶質(zhì)保留的迅速改變。3種溶劑中甲醇的氫鍵作用傾向大，吸附到固定相上的數(shù)量多，相當(dāng)于流動相中有機(jī)相的含量降低，所以咖啡因的保留增強(qiáng)。與甲醇相比，異丙醇由于碳鏈的增長使其親水性降低，與固定相表面活性點(diǎn)的作用減弱，因而遺留在流動相中的數(shù)量相比甲醇要多，洗脫能力增強(qiáng)，所以咖啡因在其中的保留比在甲醇中弱。而乙腈是非質(zhì)子化溶劑，不與固定相表面的硅羥基作用，存在于流動相中的乙腈數(shù)量相對較多，相當(dāng)于流動相洗脫能力增強(qiáng)，所以咖啡因在其中的保留時間最短。

實(shí)驗結(jié)果表明，有機(jī)溶劑的類型對咖啡因的保留有著重要影響。由于待測物在乙腈中的洗脫時間最短，所得色譜峰最為尖銳、柱效高(n=31 600/m)、峰形對稱性好(As=1.161)，而在其它兩種體系中均出現(xiàn)嚴(yán)重拖尾現(xiàn)象，因此選擇乙腈體系測定咖啡因。

2.1.2 有機(jī)溶劑含量的選擇 進(jìn)一步考察了流動相中乙腈含量對咖啡因保留值的影響(見圖2)。在乙腈含量小于50%時，隨流動相中乙腈含量的增加，溶質(zhì)的保留值下降，表現(xiàn)出類似反相色譜的特性。類似結(jié)果也出現(xiàn)在阿替洛爾的分析中［17］，因此選擇乙腈的最佳含量為5%。

圖2 流動相中乙腈含量對咖啡因保留因子的影響Fig.2 Effect of ACN content in mobile phase on retention factors of caffeine

2.1.3 緩沖溶液pH值的選擇 流動相pH值同時影響到溶質(zhì)和硅膠表面硅羥基的電離，進(jìn)而影響溶質(zhì)的保留。本實(shí)驗考察了pH值對咖啡因保留因子的影響。當(dāng)pH值由2.5升至6.4的過程中，咖啡因的洗脫時間先隨pH值的增加而延長，達(dá)到最大值后，隨pH值的增加，保留反而減弱(見圖3)，說明擬反相色譜中溶質(zhì)的保留機(jī)理是混合機(jī)理，除了分配作用，還存在一定的離子交換作用［16］。

圖3 pH值對咖啡因保留因子的影響Fig.3 Effect of pH value of mobile phase on retention factors of caffeine

2.1.4 離子強(qiáng)度的影響 由圖4可以看出，隨體系中甲酸鈉濃度的增加，咖啡因的保留時間不斷縮短。說明離子強(qiáng)度增加時，體系中帶正電荷的陽離子可與質(zhì)子化的咖啡因競爭固定相上的活性保留中心，導(dǎo)致溶質(zhì)的保留值減弱。與上述由pH值體現(xiàn)的擬反相色譜中溶質(zhì)的保留機(jī)理是基于分配作用和離子交換作用的雙重作用相一致。

圖4 體系中離子強(qiáng)度對咖啡因保留時間的影響Fig.4 Effect of ionic strength in mobile phase on retention time of caffeine

通過上述實(shí)驗，結(jié)合保留強(qiáng)度和柱效等因素確定測定咖啡因的流動相為:乙腈與甲酸鈉緩沖液(0.03 mol·L－1，pH 2.9)(5 ∶95)。

2.2 線性范圍、檢出限、重現(xiàn)性及回收率

將配制好的系列濃度咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積對咖啡因濃度(mg·L－1)作線性回歸分析。結(jié)果顯示，咖啡因的線性范圍為0.2～1 000 mg·L－1，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 5，檢出限(S/N=3)為0.05 mg·L－1。我國目前的國標(biāo)中尚無對食品中咖啡因含量的規(guī)定(只有一個對于可樂飲料的咖啡因限定，含量不超過0.15 g·kg－1)［18］。該方法較寬的線性范圍可以滿足不同食品中咖啡因含量的測定。

精密吸取20 mg·L－1咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL，進(jìn)樣10次平行測定，測得峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8%，保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，說明該方法的重現(xiàn)性好。

在已知咖啡因含量的奶茶制備液中加入咖啡因標(biāo)準(zhǔn)液適量，加水稀釋、定容，過濾后吸取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖，每個樣品平行進(jìn)樣5次，計算方法的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(見表1)。由表1可知，平均回收率為98%～103%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%～3.6%，說明本方法具有很好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 奶茶中咖啡因的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of caffeine in milk tea(n=5)

2.3 實(shí)際樣品的測定

奶茶中的茶粉含有咖啡因，將所建立的擬反相液相色譜法用于12種奶茶中咖啡因含量的測定，以檢驗方法的實(shí)用性。所測12個樣品均經(jīng)溶解、離心、過濾處理后進(jìn)樣測定，所得譜圖見圖5。由圖5可見，盡管不同品牌的奶茶組成復(fù)雜，成分各異，但除了目標(biāo)物咖啡因的保留較強(qiáng)外，大多數(shù)組分在該色譜模式下幾乎無保留或保留很弱，使得咖啡因均可與共存干擾組分實(shí)現(xiàn)基線分離，表明該方法對咖啡因測定具有高選擇性。表2中列出了12種奶茶中咖啡因的含量。結(jié)果顯示，12種奶茶中咖啡因的含量在0.386 1～1.617 2 g·kg－1之間。目前，對于奶茶中咖啡因含量測定的研究未見報道，尚無數(shù)據(jù)可比較。國家衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)可樂飲料的咖啡因限定含量為不超過0.15 g·kg－1［18］。如果將奶茶看作飲料，則其中咖啡因的含量均超出標(biāo)準(zhǔn)值;若當(dāng)作茶看待，則低于茶葉中咖啡因的含量(一般＜40 g·kg－1)。但喜歡喝奶茶的人群主要為兒童、青少年，所以奶茶中的咖啡因需要謹(jǐn)慎對待。

圖5 奶茶中咖啡因的色譜圖Fig.5 Chromatograms of caffeine in milk tea the numbers denoted were the same as those in Table 2

表2 市售奶茶中咖啡因的測定結(jié)果(n=5)Table 2 Analytical result of caffeine in commercially available samples(n=5)

3 結(jié)論

本文利用擬反相液相色譜法快速測定了奶茶中咖啡因的含量，系統(tǒng)地探討了影響咖啡因保留的因素。與反相液相色譜法相比，硅膠色譜柱更為價廉，且該方法的分析速度快，在流動相中只需極少量的有機(jī)溶劑，即可實(shí)現(xiàn)快速高通量連續(xù)運(yùn)行，極大節(jié)約了測試成本，同時降低了對環(huán)境的污染。該法的線性范圍寬、靈敏度好、回收率高、精密度好，可用于多種奶茶中咖啡因的測定。

［1］ vorc L，Tomcˇík P，Svítková J，Rievaj M，Bustin D．Food Chem．，2012，135(3):1198 －1204．

［2］ Guo S J，Zhu Q Q，Yang B C，Wang J，Ye B X．Food Chem．，2011，129(3):1311 －1314．

［3］ Alpdogan G，Karabina K，Sungurd S．Turk J.Chem．，2002，26(2):295－302．

［4］ Najafi N M，Hamid A S，Afshin R K．Microchem.J．，2003，75(3):151 －158．

［5］ Chen C N，Liang C M，Lai J R，Tsai Y J，Tsay J S，Lin J K．J.Agric.Food Chem．，2003，51(25):7495 －7503．

［6］ Srdjenovic B，Djordjevic－Milic V，Grujic N，Injac R，Lepojevic Z．J.Chromatogr.Sci．，2008，46(2):137 －143．

［7］ Zuo Y G，Chen H，Deng Y W．Talanta，2002，57(2):307－316．

［8］ Hideki H，Atsushi N，Tomomi U，Katsunori K．J.Chromatogr.A，2002，942(1/2):271－273．

［9］ Pura Naik J．J.Agric.Food Chem．，2001，49(8):3579 －3583．

［10］ Wang J Q，Jia L，Xia M．Mod.Food Sci.Technol．(王嘉琦，賈麗，夏敏．現(xiàn)代食品科技)，2011，27(1):114－116．

［11］ Crommen J．J.Chromatogr．，1979，186:705 －724．

［12］ Cox G B，Stout R W．J.Chromatogr.A，1987，384(2):315－336．

［13］ Gritti F，Pereira A S，Sandra P，Guiochon G．J.Chromatogr.A，2009，1216(48):8496－8504．

［14］ Gritti F，Pereira A S，Sandra P，Guiochon G．J.Chromatogr.A，2010，1217(5):683－688．

［15］ Li Y Y，Li J，Chen T，Liu X Y，Zhang H X．J.Chromatogr.A，2011，1218(11):1503－1508．

［16］ Li Y Y，Li J，Chen T，Liu X Y，Zhang H X．Anal.Chim.Acta，2012，726:102－108．

［17］ Dong L L，Wang C P．Chin.J.Anal.Lab.(董麗麗，王春平．分析試驗室)，2013，32(1):114－116．

［18］ GB 2760 －2011．Hygienic Standards for Uses of Food Additives．National Standards of the Peoples Republic of China(食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)．中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn))．