穿刺巴斯德芽菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

賀 樂(lè)， 黃惠琴， 朱 軍， 劉 敏， 孫前光， 鮑時(shí)翔

（1.海南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，海口 570228；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 571101）

根結(jié)線蟲（Meloidogynespp.）是經(jīng)濟(jì)作物的重要病原線蟲之一［1］。全世界主要農(nóng)作物因根結(jié)線蟲造成的直接經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)500多億美元［2］，其中北方根結(jié)線蟲（M.haplaChitwood）、南方根結(jié)線蟲［M.incognita（Kofoid et White）］、爪哇根結(jié)線蟲［M.javanica（Treub）］和花生根結(jié)線蟲［M.arenaria（Neal）］4種最常見(jiàn)的根結(jié)線蟲病害占全部損失的90%以上［3］。在全球變暖的大趨勢(shì)下，根結(jié)線蟲病害將更為嚴(yán)重。

穿刺巴斯德芽菌［PasteuriapenetransThome（Sayre ＆Starr）］為革蘭氏陽(yáng)性菌［4］，專性寄生于根結(jié)線蟲［5］，能夠顯著抑制線蟲病害，提高作物產(chǎn)量［6］。相對(duì)于廣泛使用的防治根結(jié)線蟲的化學(xué)藥品，它對(duì)環(huán)境無(wú)污染，是一種理想的生防菌劑材料［5］。然而，穿刺巴斯德芽菌尚未實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，且該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)多變，難以定性、定量觀察。同時(shí)，該菌與根結(jié)線蟲的寄生關(guān)系存在一定特異性，特定菌株只能高效寄生于某一種或幾種線蟲。尋找到廣譜寄生的菌株資源，是穿刺巴斯德芽菌商業(yè)化應(yīng)用的前提之一［7］。因此，建立一種特異性較高的穿刺巴斯德芽菌定性、定量檢測(cè)方法，對(duì)該菌培養(yǎng)方法的優(yōu)化和菌株資源的尋找都有著重要意義。

本文驗(yàn)證了穿刺巴斯德芽菌16S r DNA中一段序列的特異性，優(yōu)化了熒光定量PCR反應(yīng)體系，并以質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建了定量曲線，建立了能定性、定量檢測(cè)該菌的熒光定量PCR方法。同時(shí)確定了該體系用于檢測(cè)含穿刺巴斯德芽菌土壤樣品時(shí)的可檢測(cè)菌體濃度閾值。

1 材料與方法

1.1 菌株與土樣

枯草芽胞桿菌由本實(shí)驗(yàn)室保存；穿刺巴斯德芽菌芽胞分離自感染根結(jié)線蟲的胡椒根；根結(jié)線蟲病土采自五指山潘陽(yáng)鎮(zhèn)和萬(wàn)寧萬(wàn)城鎮(zhèn)的胡椒根結(jié)線蟲病地；不含穿刺巴斯德芽菌的土壤樣品為采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)地以及清瀾港紅樹林土壤的等比例混合物。

試驗(yàn)中用到的主要試劑和儀器有：SYBR?Premix Ex TaqTM（Ta KaRa公司）、PCR Taq Mix（康為世紀(jì)公司）、質(zhì)粒快速提取試劑盒（Omega公司）、載體p MD 19－T vector（Ta KaRa公司）、DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞（全式金公司）、DNA凝膠回收試劑盒（Biomega公司）、土壤DNA提取試劑盒（MP公司）、PCR儀（Biometra公司）、MX3005P熒光定量PCR儀（Stratagene公司）、Fastprep 24TM核酸提取儀（MP公司）。

1.2 穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA提取

收集含穿刺巴斯德芽菌芽胞的雌蟲，壓破，制成懸浮液，2 000×g低速離心1 min，取上清，去除線蟲蟲體等雜質(zhì)。

取芽胞液500μL，加入盛有無(wú)菌玻璃珠的離心管中，添加等體積酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）溶液；將離心管置于FastprepTM核酸提取儀中，6.5 m／s，破碎180 s；14 000×g離心10 min，取上清，加入等體積氯仿∶異戊醇（24∶1），搖勻再次離心；取上清，加入兩倍體積的無(wú)水乙醇，輕搖混勻，－20℃沉淀過(guò)夜；4℃，14 000 g離心10 min，輕倒乙醇，加入500μL的70%乙醇清洗2～3次，自然風(fēng)干，加入20μL無(wú)菌水溶解，－20℃保存待用。

1.3 枯草芽胞桿菌總DNA提取

挑取適量枯草芽胞桿菌菌體溶解于500μL水溶液，參照1.2方法提取總DNA。

1.4 土壤總DNA提取

按照MP公司土壤DNA提取試劑盒提取土壤樣品總DNA［8］，DNA溶液 －20℃保存。

1.5 熒光定量PCR特異性評(píng)價(jià)

以穿刺巴斯德芽菌16S r DNA目的片段為靶點(diǎn)，設(shè)穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以不含穿刺巴斯德芽菌的土壤總DNA以及枯草芽胞桿菌總DNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，評(píng)價(jià)靶點(diǎn)特異性。

熒光定量PCR體系正向引物（617F）：CGTGTAAGCGTTCGAAACGGT，反向引物 （1166R）：CGCCGGCTGTCTCTCCAA［9］。 循 環(huán) 參 數(shù)：94 ℃預(yù)變性30 s，接著40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)的程序包括94℃變性7 s、55℃退火15 s、72℃延伸15 s，在55℃末采集熒光。循環(huán)結(jié)束后，從55℃逐步上升至95℃，全過(guò)程收集熒光數(shù)據(jù)，用于構(gòu)建熔解曲線。試劑參考SYBR?Premix Ex TaqTM說(shuō)明書添加。

1.6 PCR體系優(yōu)化

用Oligo軟件計(jì)算出引物的Tm值，在Tm值上、下波動(dòng)5℃的范圍內(nèi)篩選反應(yīng)最適退火溫度。每個(gè)溫度重復(fù)兩次，取平均值，利用Mx3005P儀器附帶軟件比較各退火溫度的差異。選取正、反向引物100、300、600、900 nmol／L 等4個(gè)不同濃度分別組合，進(jìn)行qPCR反應(yīng)引物濃度的優(yōu)化。

1.7 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以穿刺巴斯德芽菌芽胞總DNA為模板，擴(kuò)增靶序列。使用DNA凝膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物。將目的片段連接至p MD 19－T vector，轉(zhuǎn)入大腸桿菌培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作說(shuō)明提取質(zhì)粒；使用純水作參照，測(cè)定重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，計(jì)算重組標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的拷貝濃度。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

利用最佳反應(yīng)條件對(duì)10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（2.48～2.48×106拷貝／PCR）進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，確定靶點(diǎn)檢測(cè)靈敏度。以起始模板濃度對(duì)數(shù)為x軸，Ct值為y軸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線；重復(fù)4次試驗(yàn)，求取Ct值平均數(shù)和變異系數(shù)，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性和可重復(fù)性。

1.9 土壤樣品的熒光定量PCR測(cè)定

分別將含有1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102個(gè)穿刺巴斯德芽菌芽胞的300μL芽胞液加入0.5 g無(wú)穿刺巴斯德芽菌土壤樣品中，提取該6份土壤樣品以及采自潘陽(yáng)鎮(zhèn)、萬(wàn)城鎮(zhèn)的根結(jié)線蟲胡椒病地土樣總DNA，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，測(cè)定土壤中穿刺巴斯德芽菌芽胞最低的可檢測(cè)濃度以及2份病土中該菌菌體濃度。

2 結(jié)果

2.1 靶點(diǎn)特異性評(píng)價(jià)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該靶點(diǎn)只對(duì)穿刺巴斯德芽菌總DNA能產(chǎn)生擴(kuò)增信號(hào)，無(wú)穿刺巴斯德芽菌土壤總DNA、枯草芽胞桿菌總DNA均無(wú)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小約為550 bp，與目的片段大小相符。因而，該靶點(diǎn)對(duì)穿刺巴斯德芽菌具有良好的特異性。

2.2 熒光定量PCR體系優(yōu)化

退火溫度優(yōu)化試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線（圖1）顯示，在57～60℃之間時(shí)Ct值與平臺(tái)期熒光值變化較小，61℃時(shí)熒光值顯著減小，為保證反應(yīng)效率以及特異性，選取最佳退火溫度為60℃。

圖1 引物退火溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of the annealing temperature for the primers

引物濃度優(yōu)化結(jié)果（圖2）顯示，正、反向引物濃度分別為900、300 nmol／L時(shí)Ct值最小，故選定此濃度組合為最佳的引物濃度。

圖2 引物濃度優(yōu)化Fig.2 Optimization of the concentration for the primers

2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及標(biāo)準(zhǔn)曲線

提取經(jīng)多次純化的陽(yáng)性克隆菌落的質(zhì)粒，利用特異靶點(diǎn)的引物對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得大小約550 bp的片段，與目的片段相符；BLAST分析質(zhì)粒DNA序列顯示，插入片段與目的片段的同源性為100%，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液A260／A280值為1.8，DNA純度較高。經(jīng)計(jì)算，溶液拷貝濃度為2.48×1013拷貝／PCR。

熒光定量PCR反應(yīng)時(shí)，在設(shè)置的質(zhì)粒樣品濃度梯度樣品中，當(dāng)拷貝濃度為24.8拷貝／PCR時(shí)產(chǎn)生特異擴(kuò)增，而在濃度為2.48拷貝／PCR時(shí)，則無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。表明該靶點(diǎn)對(duì)質(zhì)粒樣品拷貝數(shù)的可檢測(cè)閾值為24.8拷貝／PCR。

以6個(gè)濃度梯度質(zhì)粒樣品（24.8～2.48×106拷貝／PCR）的Ct值和質(zhì)粒拷貝濃度對(duì)數(shù)為坐標(biāo)軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y＝－3.200×logx＋34.43，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，擴(kuò)增效率為105.4%（圖3）。重復(fù)測(cè)定4次，6個(gè)濃度梯度質(zhì)粒樣品的Ct值的平均值依次為30.64±0.12、28.18±0.08、24.42±0.12、21.29±0.15、17.66±0.07、15.25±0.09，對(duì)應(yīng)變異系數(shù)分別為0.41%、0.30%、0.49%、0.72%、0.40%、0.58%，均小于5%；標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠，重復(fù)性良好，可用于穿刺巴斯德芽菌的定量檢測(cè)。

2.4 土壤樣品的熒光定量PCR檢測(cè)

針對(duì)人工添加穿刺巴斯德芽菌芽胞的土壤樣品，檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示Ct值隨土壤中芽胞濃度的增加而減小；當(dāng)芽胞濃度在2×103個(gè)／g土壤或者以上時(shí)，PCR反應(yīng)產(chǎn)生特異性擴(kuò)增；而芽胞濃度為2×102個(gè)／g土壤時(shí)，無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。因而，以所選靶點(diǎn)為基礎(chǔ)的熒光定量PCR檢測(cè)方法，對(duì)土壤中穿刺巴斯德芽菌芽胞的最低可檢測(cè)芽胞濃度為2×103個(gè)／g土壤。

對(duì)胡椒根結(jié)線蟲病地土壤樣品進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，潘陽(yáng)鎮(zhèn)土樣有特異性擴(kuò)增信號(hào)，且Ct值與芽胞數(shù)量2×103個(gè)／g土壤樣品接近；萬(wàn)城鎮(zhèn)土樣無(wú)擴(kuò)增信號(hào)。這表明潘陽(yáng)土樣中含有穿刺巴斯德芽菌，芽胞含量約為2×103個(gè)／g土壤，而萬(wàn)城鎮(zhèn)土樣中沒(méi)有穿刺巴斯德芽菌或者其濃度小于可檢測(cè)閾值。

3 討論

熒光定量PCR是一種快速、特異性高的檢測(cè)方法，在微生物的定性、定量檢測(cè)上運(yùn)用廣泛。目前，尚無(wú)該方法檢測(cè)穿刺巴斯德芽菌培養(yǎng)樣品及土壤樣品的報(bào)道。本文以穿刺巴斯德芽菌16S r DNA中的片段為靶點(diǎn)，經(jīng)過(guò)特異性驗(yàn)證和反應(yīng)條件優(yōu)化，構(gòu)建了該菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法；此方法對(duì)含穿刺巴斯德芽菌芽胞土壤樣品的可檢測(cè)芽胞濃度閾值為2×103個(gè)／g土壤，靈敏度與PasteurianishizawaeSayre et al.土壤樣品的可檢測(cè)閾值處于同一水平［10］。挑取兩處病地胡椒根結(jié)中成熟雌蟲進(jìn)行顯微觀察時(shí)，發(fā)現(xiàn)從潘陽(yáng)鎮(zhèn)采集的胡椒根中有大量穿刺巴斯德芽菌，在萬(wàn)城鎮(zhèn)病地中則未發(fā)現(xiàn)。

在該菌的培養(yǎng)方面，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期探索，本課題組已脫離植物成功實(shí)現(xiàn)人工擴(kuò)培，但尚未實(shí)現(xiàn)純培養(yǎng)，且該菌在生長(zhǎng)過(guò)程中形態(tài)多變，通過(guò)顯微觀察等方法難以對(duì)其進(jìn)行定性、定量檢測(cè)。以特異性、靈敏度見(jiàn)長(zhǎng)的熒光定量PCR檢測(cè)方法，是該菌定量檢測(cè)的最佳選擇之一。熒光定量PCR中，用于定量的標(biāo)準(zhǔn)品一般有菌體總DNA、質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物3種。由于穿刺巴斯德芽菌尚未被純培養(yǎng)，且野外菌株資源難以獲取，若以總DNA為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)該菌進(jìn)行定量，有一定的局限性。PCR產(chǎn)物作為標(biāo)準(zhǔn)品則有保存周期短、拷貝數(shù)難以確定等缺點(diǎn)。本文以保存更長(zhǎng)久且拷貝濃度確定的重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了標(biāo)準(zhǔn)曲線。本方法對(duì)質(zhì)粒樣品的檢測(cè)限為24.8拷貝／PCR，該值與任月等［11］所構(gòu)建的糞便中腸球菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的檢測(cè)限在同一水平。此定量檢測(cè)方法對(duì)穿刺巴斯德芽菌的特異性較高，檢測(cè)濃度范圍廣、靈敏度高，可用于該菌的定量檢測(cè)。

［1］謝輝.植物線蟲分類學(xué)［M］.合肥：安徽科學(xué)技術(shù)出版社，2000：20－80.

［2］Charles L，Carbone I，Davies K，et al.Phylogenetic analysis ofPasteuriapenetransby use of multiple genetic loci［J］.Jour－nal of Bacteriology，2005，187（16）：5700－5708.

［3］Johnson A W，F(xiàn)assuliotis G.Nematode parasites of vegetable crops［M］∥Nickle W R.Plant and insect nematodes.New－York：Basel Marcel Decker Inc，1984：323－372.

［4］Sayre R，Starr M.Pasteuriapenetrans（ex Thorne 1940）nom.rev.，comb.n.sp.n.a mycelial endospore－forming bacterium parasitic in plant－parasitic nematodes［J］.Proceedings of the Helminthological Society of Washington，1985，52：149－165.

［5］Sayre R M，Wergin W P，Schmidt J M，et al.Pasteurianishizawaesp.nov，a mycelial and endospore－forming bacterium parasitic on cyst nematodes of generaHeteroderaandGlobodera［J］.Research in Microbiology，1991，142：551－564.

［6］Giannakou I O，Pembroke B，Gowen S R，et al.Effects of long term storage and above normal temperatures on spore adhesion ofPasteuriapenetransan infection of root－knot nematodeMeloidogynejavanica［J］.Nematologica，1997，43：185－192.

［7］Davies K G.Understanding the interaction between an obligate hyperparasitic bacterium，Pasteuriapenetransand its obligate plant－parasitic nematode host，Meloidogynespp.［J］.Advance in Parasitology，2009，68：211－45.

［8］Jacob B?lum，Trine H，Hans C，et al.Degradation of 4－chloro－2－methylphenoxyacetic acid in top－and subsoil is quantitatively linked to the classⅢtf dagene［J］.Applied and Environmental Microbiology，2006，72：1476－1486.

［9］Duan Y P，Castro H F，Hewlett T E，et al.Detection and characterization ofPasteuria16S r RNA gene sequences from nematodes and soils［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2003，53：105－112.

［10］Ndeme A，Mohammad B，Gregory N.A real－time PCR assay for the detection ofPasteurianishizawaein soil［C］∥American Phytopathological Society Annual Meeting，2008.

［11］任月，袁杰利，盧行安，等.糞便中腸球菌SYBR GreenI熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立［J］.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志，2007（6）：499－501.