甘肅省保護地蔬菜根結線蟲種類鑒定及其rDNA－ITS序列分析

杜 蕙， 漆永紅， 呂和平， 陳書龍， 陳 明＊

（1.甘肅省農業科學院植物保護研究所，蘭州 730070；2.河北省農林科學院植物保護研究所，保定 071000）

根結線蟲（Meloidogynespp.）是一類在蔬菜作物上危害極大的植物病原線蟲，其寄主范圍廣，種類多，分布廣，能侵染幾乎所有蔬菜作物。據調查，2008年根結線蟲病僅在甘肅省局部地區的保護地蔬菜上發生，隨著種植結構的調整，人為因素等影響，蔬菜根結線蟲病發生日趨嚴重，現已蔓延到幾乎全省保護地蔬菜產區，造成嚴重的產量損失，給蔬菜生產帶來巨大的影響［1－2］。

根結線蟲種類鑒定除傳統的形態學、鑒別寄主反應、生物化學和細胞遺傳學等方法外，r DNA－ITS－PCR技術已被用于根結線蟲的快速分子診斷和從混合種群中識別根結線蟲種類。Zijlstra等采用ITS－RFLP技術鑒定出了北方根結線蟲（M.haplaChitwood）、奇 特 伍 德 根 結 線 蟲 （M.chitwoodiGolden et al.）和法拉克斯根結線蟲 （M.fallaxKarssen）3種十分相近的根結線蟲種群［3］。Blok等利用5S和18S引物之間的ITS區域揭示了爪哇根結線蟲［M.javanica（Treub）］、花生根結線蟲［M.arenaria（Neal）］、南方根結線蟲［M.incognita（Kofoid et White）］、瑪亞圭根結線蟲（M.mayaguensisRammah et Hirschmann）和北方根結線蟲的種內和種間變異［4］。彭德良等用PCR技術研究了40多個根結線蟲群體的r DNA－ITS基因，明確了北方根結線蟲、爪哇根結線蟲、南方根結線蟲等6種根結線蟲的ITS位點序列特征［5］。廖金鈴等研究并建立了用r DNA－ITS、線粒體DNA－PCR－RFLP和SCAR方法快速鑒定根結線蟲的方法［6］。但是，尚未對甘肅省根結線蟲種類開展研究。本試驗以采自甘肅省11個不同區域保護地蔬菜根結線蟲種群為研究對象，采用ITS標記，將PCR擴增產物進行測序，分析根結線蟲的同源性和親緣關系，鑒定甘肅省不同區域蔬菜根結線蟲種類，對根結線蟲病害快速診斷、種群遺傳多樣性研究及根結線蟲病害防治具有重要的實際意義。

1 材料與方法

1.1 供試線蟲

供試根結線蟲于2008－2011年從甘肅省9個市不同區域保護地蔬菜上采集，分別進行單卵塊純化培養后接種于預先培植于消毒土的番茄（品種為‘毛粉802’）根部（約25 d苗齡），在溫室中培養45 d左右，獲得純培養種群11個（表1）。

表1 供試蔬菜根結線蟲樣本采集信息Table 1 Origins of the tested vegetable root－knot nematodes

1.2 試劑和儀器

PCR所用的Taq酶，d NTP，Buffer均購自TIAN GEN生化科技生物技術有限公司。

試驗儀器為：MJ PTC－100 PCR儀，JY 600＋電泳儀，Heraeus臺式高速離心機，FTI－500凝膠成像分析系統。

1.3 根結線蟲DNA提取

參照王江嶺等單條線蟲基因組DNA提取方法稍作改進［7］。具體方法為：將從新鮮卵囊里孵化出的根結線蟲2齡幼蟲放入dd H2O中清洗，挑取單條放入200μL PCR管中（含8μL dd H2O和1μL 10×PCR Buffer），超低溫冰箱－80℃放置4 h，85℃加熱2 min，向PCR管中加入1μL 20 mg／m L蛋白酶K，56℃加熱15 min，95℃加熱10 min，高速離心（14 000 r／min）1 min，取此 DNA 上清液直接進行PCR擴增。

1.4 PCR擴增

采用Harris等［8］設計的線蟲ITS擴增通用引物F195和V5367（由上海生工公司合成），其序列分別 為：5′－TCCTCCGCTAAATGATATG－3′和 5′－TTGATTACGTCCCTGCCCTTT－3′，對 11 個 縣（區）根結線蟲種群的ITS間隔區進行擴增。PCR擴增采用25μL反應體系，其中10×PCR Buffer 2.5μL，2.5 mmol／L d NTP 1μL，5μmol／L 引物F195和V5367各1μL，2.5U／μLTaq酶0.5μL，DNA提取上清液3μL，加dd H2O至25μL。同時設置無DNA模板的空白對照CK。PCR擴增條件為：95℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，反應共35個循環；最后72℃延伸10 min。4℃ 保存備用。PCR產物采用1.5%的瓊脂糖凝膠120 V電泳30 min進行檢測，用1×TBE作為電泳緩沖液，并在紫外燈下觀測照相。

1.5 PCR產物序列測定、序列分析及同源性比較

將PCR產物送上海生物工程有限公司進行序列測定。采用MEGA軟件對所測定的序列進行比對分析，比較11個不同地區根結線蟲種群ITS序列的同源性。

2 結果與分析

2.1 根結線蟲形態學鑒定結果

對甘肅省11個不同區域根結線蟲進行了形態學方面的鑒定，根據其2齡幼蟲、雌蟲會陰花紋及卵的形態學特征（圖1），初步確定11個不同地區保護地蔬菜根結線蟲均為南方根結線蟲（M.incognita）。

圖1 供試根結線蟲的形態特征Fig.1 The morphological characters of root－knot nematodes in the experiment

2.2 r DNA－ITS－PCR擴增產物電泳檢測結果

用引物F195和V5367對甘肅省11個不同地區根結線蟲單條2齡幼蟲進行r DNA－ITS－PCR擴增后，用瓊脂糖凝膠電泳檢測，各地區線蟲樣本的ITS片段大小為700 bp左右（圖2）。

圖2 11個根結線蟲樣品ITS片段的PCR擴增電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR product of ITS fragment from 11 root－knot nematode samples

2.3 序列測定結果

對11個根結線蟲種群的rDNA－ITS序列進行測定，結果表明，11個蔬菜根結線蟲種群的ITS片段大小介于690～695 bp之間。其中白銀市靖遠縣北灣鎮、定西市臨洮縣新添鎮、定西市隴西縣文峰鎮、平涼市涇川縣五里鋪鎮4地根結線蟲ITS片段大小均為691 bp；蘭州市榆中縣和平鎮、隴南市成縣城關鎮、天水市麥積區中灘鎮3地根結線蟲ITS片段大小均為690 bp；慶陽市西峰區塞子鄉、定西市漳縣三臺鄉、酒泉市肅州區上壩鎮、武威市涼州區清源鎮4地根結線蟲ITS片段大小均為695 bp。

2.4 序列分析及同源性比較結果

經測序后，將11個根結線蟲樣本的r DNA－ITS區域序列與GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）數據庫進行Nucleotide BLASTN序列比對，結果表明，獲得的擴增產物ITS區域序列與已知南方根結線蟲ITS區域序列的相似性達到99%。用MEGA 4.0軟件構建系統發育樹（圖3）。從系統發育樹可以看出，11個根結線蟲樣本與南方根結線蟲的遺傳距離最近，而與其他根結線蟲的遺傳距離相對較遠，說明甘肅省9個市的保護地蔬菜根結線蟲均為南方根結線蟲（M.incognita）。

3 結論與討論

由于根結線蟲的形態特征在進化過程中比較保守，不同線蟲種類之間的形態特征差異較小，相對來講同種內不同種群之間的特征變異幅度又較大，一般僅靠形態特征不能對根結線蟲進行準確的鑒定。近年來分子生物學特征對線蟲進行種類鑒定，已成為線蟲種類鑒定的發展趨勢。線蟲基因組DNA提取是線蟲分子生物學研究的基礎，國內外一些學者用堿裂 解 法［9］、蛋 白 酶 K 法［10］、試 劑 盒 法［11］以 及SDS法［12］等對提取單頭線蟲DNA的方法進行了摸索和改進，取得一些進展。本試驗采用PCR Buffer溶液替代WLB裂解液，使用變溫處理替代其他手工破碎能夠快速提取單頭線蟲DNA，本方法可供提取其他線蟲基因組DNA所借鑒。

圖3 基于11個根結線蟲樣本和來自GenBank不同種類根結線蟲ITS區序列構建的系統進化樹Fig.3 The phylogenetic tree of 11 samples and related Meloidogyne spp.from GenBank based on their ITS sequences

王仁剛等對北京地區保護地蔬菜根結線蟲用形態學和r DNA－ITS序列分析進行鑒定，發現南方根結線蟲不僅廣泛分布于我國南方地區，在北方北京地區溫室蔬菜上也有分布［13］。本研究采用r DNAITS－PCR方法，結合供試根結線蟲形態學特征，所有根結線蟲樣品均被鑒定為南方根結線蟲（M.incognita），供試的根結線蟲樣品來自甘肅省14個市州中的9個市的不同區域，11個采樣點均為目前甘肅省的主要保護地蔬菜產區，具有較強的代表性，可以基本反映全省的狀況，表明南方根結線蟲在甘肅省保護地內已普遍發生，值得引起相關部門的高度重視。

［1］高赟，漆永紅，劉永剛，等.甘肅河西地區番茄根結線蟲病病原鑒定［J］.植物保護，2009，35（3）：127－131.

［2］漆永紅，呂和平，杜蕙，等.甘肅武威市黃瓜根結線蟲病病原鑒定［J］.甘肅農業科技，2009（9）：9－11.

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［13］王仁剛，簡恒，向紅瓊，等.北京地區保護地蔬菜根結線蟲種類鑒定［J］.植物保護，2007，33（3）：90－92.