殼聚糖對青枯勞爾氏菌生長及其生物膜形成的影響

蘇 婷， 王桂躍＊， 謝關林

（1.浙江省東陽玉米研究所，東陽 322100； 2.浙江大學生物技術研究所，杭州 310029）

青枯勞爾氏菌［Ralstoniasolanacearum（Smith）Yabuuchi et al.］能引起系統侵染的毀滅性土傳病害，即作物青枯病。該病原的寄主范圍廣泛，可侵染44個科的數百種植物［1］。殼聚糖是由甲殼素經脫乙酰化處理后的產物，具有良好的生物相容性，可生物降解且無毒副作用，廣泛存在于蝦、蟹等動物外殼和藻類、真菌的細胞壁中［2－3］。殼聚糖是一種抗菌譜較廣的天然物質，對細菌、真菌和病毒等均有不同程度的抑制作用。早在19世紀80年代末，Kendra［4］就發現殼聚糖對鐮刀菌等具有抑制效果，而經殼聚糖溶液處理過的番茄植株能有效抑制Phytophthorainfestans菌絲的生長，防止番茄早疫病的大面積發生［5］。殼聚糖種子處理后，辣椒幼苗能提高誘導抗性，預防Colletotrichumsp.的感染［6］。Li［7］等研究發現殼聚糖能抑制Pseudomonasfluorescens，防止西蘭花頭腐病的發生。

細菌生物膜通常是附著在固體表面的微生物群體，其主要成分包括胞外多糖、胞外蛋白以及一些核酸［8］。生物膜的存在有助于細菌抵御不良的外界環境以及有害物質的侵蝕，維持其生存環境的相對穩定，這是細菌所具有的一種非常重要的環境適應機制［9］。

本研究室已發現殼聚糖能有效防治番茄青枯病的發生，其土壤澆灌和種子處理后的防治效果分別達71.99%和48.01%［10］。本文通過檢測不同濃度的殼聚糖溶液在不同時間段對青枯菌的抑菌效果，了解殼聚糖對青枯菌生長及其生物膜形成的影響，為殼聚糖控制植物青枯病提供更有利的理論依據。

1 材料與方法

1.1 殼聚糖的制備

將脫乙酰度為75%的殼聚糖粉末（購自Sigma公司）溶解于體積分數為1%的乙酸中，配制成濃度為10 mg／m L 的 殼 聚 糖 溶 液，調 p H 至 5.6［3］，121℃滅菌20 min，待用。同時將p H為5.6，體積分數為1%的乙酸溶液滅菌待用。

1.2 青枯菌菌懸液的制備

試驗所用青枯菌Rs－91菌株由福建省農業科學院提供。挑取在TZC培養基上生長的青枯菌單菌落，接種于LB液體培養基中，30℃，170 r／min振蕩培養24 h。

1.3 殼聚糖與菌懸液的混合培養

準備6個已滅菌離心管，每管按表1加入混合培養物，使殼聚糖終濃度分別達0.00、0.05、0.10、0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L。各取100μL加入到96孔培養板中（為減少誤差，培養板的邊緣孔不加培養物），每處理設10個重復。

表1 殼聚糖與菌懸液的混合培養成分Table 1 Components for mixed culture of chitosan and bacterial suspension

1.4 殼聚糖抑菌效果的檢測

將1.3制備好的混合培養物在30℃條件下分別振蕩培養24、48 h和72 h。用排槍將每個孔內的培養物混合均勻后，利用美國BIOTEK公司POW－ERWAVE XS全波長掃描式酶標儀測定在600 nm下的吸光值A600。抑菌率＝（對照組A600－試驗組A600）／對照組A600。

1.5 生物膜形成的評價

應用結晶紫的方法［11］對青枯菌在96孔培養板表面的成膜能力進行評價。將1.3制備好的混合培養物在30℃條件下分別靜置培養24、48 h和72 h，小心移去培養物后，用蒸餾水輕輕洗滌2次，然后加入100μL濃度為1%的結晶紫對殘留細胞和基質進行染色，25 min后用蒸餾水清洗2次，加入150μL二甲基亞砜以溶解吸附于生物膜上的結晶紫，測定其在570 nm下的吸光值，即A570。

1.6 透射電鏡觀察（TEM）

在1.96 m L濃度約為108cfu／m L的細菌懸浮液中加入0.04 m L濃度為10 mg／m L的殼聚糖溶液，使殼聚糖終濃度達0.2 mg／m L。混合液在28℃恒溫搖床上170 r／min振蕩培養24 h，吸取1 m L混合液置于1.5 m L離心管中，4 000 g離心10 min。離心后的菌體在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜。按照透射電鏡要求包埋處理后，在Reichert超薄切片機中切片，獲得70～90 nm的切片，該切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15 min，即可在日本JEOL公司的JEM－1230型透射電鏡中觀察。同時設置無殼聚糖處理的菌懸液為對照。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖對青枯菌生長的抑制效果

結果顯示混合培養24 h后，當殼聚糖終濃度在0.10 mg／mL和0.15 mg／mL時，兩者的A600和抑菌率存在顯著差異，而殼聚糖終濃度為0.15、0.20 mg／m L和0.25 mg／m L時，三者的A600和抑菌率在同一水平上（表2）。混合培養48 h和72 h后，當殼聚糖終濃度超過0.15 mg／m L后，其對青枯菌的抑制效果處于同一水平。

混合培養48 h后，對照組的A600高達0.629，表明此時青枯菌生長旺盛，但經殼聚糖處理后，其抑菌率均高于相同殼聚糖濃度的其他時間段，最高抑菌率達74.3%。說明在生長48 h時，青枯菌雖生長旺盛，但對外界環境因素的作用敏感，殼聚糖對其抑制效果最顯著。

表2 殼聚糖對青枯菌生長的抑制效果1）Table 2 Inhibitory effect of chitosan on the growth of Ralstonia solanacearum

2.2 殼聚糖對青枯菌生物膜形成的影響

結果顯示在培養24 h后，青枯菌生物膜形成能力較弱，殼聚糖對其未產生顯著影響，而對照組青枯菌生物膜形成量在培養48 h后達最大值，A570為0.202，隨著殼聚糖濃度的增加，青枯菌生物膜形成量越低，說明此時殼聚糖對其有一定的抑制作用（圖1）。但培養72 h后，青枯菌生物膜形成量反而降低，在無殼聚糖的條件下，其生物膜A570僅為0.151，而殼聚糖濃度的增加并未對青枯菌生物膜的形成量產生顯著影響。

2.3 殼聚糖處理青枯菌的透射電鏡觀察

未經殼聚糖處理的青枯菌在電鏡下，細胞形態完整，細胞膜清晰，邊界明顯（圖2a）。殼聚糖處理24 h后，青枯菌的細胞膜出現破損，并且被一層帶狀的物質所包裹，細胞質膜逐漸與細胞外膜分離，在細胞內部形成空泡，且細胞的形態變得不規則（圖2b）。

圖1 殼聚糖對青枯菌生物膜形成的影響Fig.1 Effect of chitosan on biofilm formation of R.solanacearum

圖2 青枯菌不處理對照（a）和0.2 mg／mL殼聚糖處理（b）在透射電鏡下的細胞形態Fig.2 Cellular morphology of R.solanacearum untreated（a，CK）and treated with 0.2 mg／m L chitosan（b）observed by transmission electron microscopy（TEM）

3 討論

大量研究表明，殼聚糖不僅能誘導植物增強自身防御反應，產生廣譜抗性，還能直接作用于病原微生物而抑制多種植物病原菌的生長［4－7］。而目前國內外報道多是用平板對峙法等檢測殼聚糖抑制植物病原細菌的生長［10］，特別是菌落計數法可能存在較大誤差，而且操作繁瑣，不利于大批量樣本的檢測。本文用酶標儀直接測定混合液體培養基的吸光值對青枯菌生長情況進行定量分析，結果顯示0.15 mg／m L的殼聚糖濃度能有效抑制青枯菌的生長，而在培養48 h時，其抑菌率最高達74.3%。

青枯勞爾氏菌的主要致病因子是胞外蛋白和胞外多聚糖［12］，這些物質正是生物膜的主要組成部分。而周智等［13］研究已發現在離體條件下殼聚糖處理后菌斑生物膜的形成能力受阻，可見殼聚糖對某些細菌的生物膜形成有抑制作用。作者檢測了不同濃度殼聚糖在不同時間段對青枯菌生物膜形成的影響，結果顯示隨著殼聚糖濃度的增加，青枯菌生物膜形成量有不同程度的降低，尤其在48 h時，其生物膜形成量逐漸降低，但未產生顯著差異。

殼聚糖能夠破壞一些細菌的外膜，如大腸桿菌、克雷柏氏桿菌、葡萄球菌等［14－15］，但對有些細菌膜的破壞并不劇烈［16］。通過殼聚糖處理青枯菌的透射電鏡觀察，我們認為殼聚糖通過破壞青枯菌的細胞膜，改變細胞膜的通透性，引起細胞內外滲透壓的失常從而抑制了細菌的生長。

殼聚糖作為一種良好的生物源農藥，具有無毒、無污染和生物相容性等優良特性，且在實際應用中施用方式簡單，使用安全，能和多種殺菌劑混合使用［2－3］，這些優良特性決定了殼聚糖在防治植物病害方面將具有廣闊的應用前景。但殼聚糖對植物病原菌抑菌反應的機理十分復雜，隨著基因工程等技術的發展，相信殼聚糖的抑菌機理將愈來愈清楚。

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