野生二粒小麥葉枯病病原菌鑒定及抗病基因遺傳特性的初步研究

劉鑫燕， 高 濤， 王 粲， 吳立偉， 汪 昕， 周 蓉， 余春梅

（南通大學生命科學學院，南通 226019）

小麥葉枯病（wheat leaf blight and spot）是引起小麥葉斑和葉枯類病害的總稱，世界上報道的葉枯病的病原菌達20多種，而殼針孢葉枯病（Septoria leaf blotch）、小麥鏈格孢葉枯病（Alternaria leaf blight）、小麥黃斑葉枯病（tan spot）等已經成為我國小麥生產的重要病害［1］。小麥感染葉枯病病菌后，常造成葉片早枯，影響籽粒灌漿，造成穗粒數減少，千粒重下降，有些葉枯病原菌還可引起籽粒的黑胚病［2］，降低小麥產量以及小麥商品糧等級。

鏈鉻孢屬（Alternaria）中有多種病菌能引起小麥的葉枯病害。20世紀60年代曾在印度發生過鏈格孢屬的A.triticina引起的病害流行，導致大約60%～75%小麥減產。王春江等［3］和商鴻生等［4］的研究認為，鏈格孢葉枯病在20世紀70年代就已經在我國的一些育種苗圃中發生，并曾在1997－1998年間，在黃河中下游和江淮麥區有較大面積的發生。由于高溫高濕條件有利于葉枯病的發生，我國黃河中下游、江淮麥區、長江流域以及西南麥區在小麥生育期的中后期通常會遭遇高溫高濕氣候，為葉枯病的大發生提供了可能的環境條件。與小麥常見的赤霉病、白粉病等相比較，該病在我國的出現相對較晚且對該病的認識尚處在起步階段。邢小萍等［5］2005－2007年度對河南省主栽小麥品種葉枯病田間發病情況進行調查，發現沒有對葉枯病免疫的品種。盡管該調查并未說明致病病菌，但至少說明了葉枯病的發生在我國小麥生產中可能具有普遍性。因此，在發生葉枯病栽培區域，鑒定引起葉枯病癥狀的病原菌種類，研究小麥中抗病基因的抗性遺傳規律，鑒定抗病基因資源，并進一步應用于育種實踐將具有積極意義。

本試驗根據科赫氏法則，從具有葉枯病癥狀的四倍體野生二粒小麥上分離了致病菌，通過孢子形態和核糖體rDNA內部轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）分子進化分析對病原菌進行了鑒定。在離體無菌條件下，對抗病與感病親本以及其雜交所得的200多個F2∶3家系進行了抗病性鑒定，初步解析了抗病基因的遺傳規律，為進一步通過分子標記定位抗病基因以及開展分子標記輔助育種奠定了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

四倍體野生二粒小麥（Triticum dicoccoides，2n＝28，AABB）親本‘JIC106003’以及‘JIC106007’引自中國科學院遺傳發育所植物細胞與染色體國家重點實驗室。本實驗室于2008年配置雜交組合，并于2009－2011年分別對F1、F2單株及F2：3家系進行了抗病性鑒定。供試葉枯病病原菌由本實驗室分離保存。

1.2 病原菌的分離純化

在試驗地取苗期（四葉期）至抽穗期的發病葉片，剪成5cm左右的小段用75%乙醇浸泡3min，無菌水沖洗1次，放入1%次氯酸鈉中浸泡30s，無菌水沖洗3次。吸取100μL最后一次洗滌用水涂布于PSA固體培養基作為無菌對照。將表面消毒的葉片，從發病區域剪取5mm×5mm大小放PSA固體培養基表面，置于28℃的培養箱內培養并觀察。將獲得的真菌進行純化后，用透明膠帶法［6］對分離到的菌絲進行制片，并用石炭酸棉蘭染液染色后進行鏡檢。

1.3 病原性試驗

按李大海等［7］的方法進行病原性試驗。首先對健康葉片進行表面消毒（同1.2），并在葉片上滴加2滴20μL真菌孢子懸浮液［（4.0～5.0）×103個／mL］，放置在光照培養箱中（24℃，12h光照）。接菌后的48h內葉片基本無病斑發展，48h后病斑逐漸發展，將能在感病親本中發病的菌株進一步培養后用于后續的分子生物學鑒定和F2∶3家系抗病性調查。

1.4 病原菌DNA的提取

用真菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶），并按其說明書進行病原菌基因組DNA的提取。

1.5 病原菌的分子鑒定以及菌落類群分析

根據 White等［8］的報道，用跨5.8rDNA基因兩側 ITS 的 引 物 ITS4：5′－TCCTCCGCTTATTGAT ATGC－3′分 別 與 ITS1：5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′和 ITS5：5′－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG－3′配對擴增，PCR反應體系為20μL，總體積中加入10ng／μL模板1μL，10×LATaq（大連寶生物）緩沖液2μL，10μmol／L上下游引物各0.2μL，2.5mmol／L的 dNTPs 2μL，適量滅菌雙蒸餾水。95℃變性5min，95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環后，72℃延伸10min進行PCR擴增。產物用1% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。并將ITS4與ITS1和ITS5配對擴增產物分別回收（鼎國公司PCR產物純化試劑盒），連接克隆于pMD18－T載體（大連寶生物），陽性菌落送上海Invitrogen公司測序。

在GenBank查找Vergnes等［9］報道的相關序列，以E.pedicillatum 作為外類群，使用Clustal W2進行多序列比對，MEGA5.0軟件中Neighbor－Joining（NJ）法進行建樹，Bootstrap值設為500。

1.6 遺傳群體中抗病性調查及評價方法

離體葉鑒定根據病斑反應型和嚴重度來確定供試材料的抗性。參照李大海等［7］的方法，進行病情調查和抗性分析。

按以下公式計算每個單株的病情發展曲線下面積（area under the disease progress curve，AUDPC）。AUDPC＝∑［（Xi＋Xi＋1）／2］（ti＋1－ti）。式中的Xi和Xi＋1分別是第i次記載和第i＋1次記載的嚴重度，ti＋1－ti是第i＋1次記載和第i次記載之間所間隔的時間。本研究根據病斑的發展，從接種72h后開始記錄病情，間隔24h，連續記錄3次。

1.7 抗病基因遺傳特性的鑒定

根據親本、F1、F2單株田間自然發病情況以及F2：3家系實驗室接種病情統計，應用質量性狀的分離規律和適合度（χ2）檢測抗病基因數目。

2 結果與分析

2.1 野生二粒小麥葉枯病表型

根據2007－2009年親本的抗病表型，抗病野生二粒小麥在自然條件下葉片無病斑（圖1a），感病野生二粒小麥葉片出現橢圓形的褪綠小斑，后病斑連接成片，中間有黑色至褐灰色，邊緣黃色。感病材料的葉片從基部直至倒二葉均有不同程度的病斑，第2片葉基本壞死，第3葉有較大面積的病斑，上部4～6葉病斑較輕（圖1b）。根據龍宗權［1］、商鴻生等［3］的研究，初步判斷是由鏈格孢葉枯病病菌引起的病害。根據田間葉枯病情況，選擇‘JIC1060003’（抗）和‘JIC1060007’（感）作為親本配置了雜交并獲得了遺傳群體。

2.2 菌的形態鑒定

使用貼片法在PSA培養基平板上共分離到兩種真菌以及酵母。通過科赫氏法則及葉片病原菌的活體（in vivo）觀察（圖2a）顯示只有一種真菌為葉枯病的致病菌。按1.3中的方法進行葉片接種72h后，接種部位呈現褪綠，中心且有褐色斑點，并在顯微鏡下觀察到菌絲（圖2a）。菌株在PSA平板上生長速率為0.5～0.6cm／d，菌落第2～3天為白色，之后中央出現灰黑色區域，氣生菌絲白色絨毛狀。鏡檢發現，其分生孢子梗單生或叢生，直立，黃褐色，大小為（17～27）μm ×（3～6）μm （圖2c）。分生孢子單生或2～4個串生，褐色，卵圓形或橢圓形，喙較短，大小（15～89）μm ×（7～30）μm，1～6個橫膈膜，1～4個縱隔膜。根據 Andersen［3－4，10］等人的描述，此菌屬于鏈格孢菌屬，但其種的特性需進一步鑒定。

圖1 野生二粒小麥葉枯病表型Fig.1 Phenotypes of the leaf blight and spot in Triticum dicoccoides

圖2 從感病葉片中分離的葉枯病病菌表型特征Fig.2 Morphology of the pathogen isolated from leaves of the susceptible genotype of T.dicoccoides‘JIC1060007’

2.3 病菌的分子生物學鑒定

為了進一步確認所分離的鏈格孢菌的類群，對核糖體5.8SrDNA以及側翼轉錄間隔區進行了擴增和進化分析。兩對真菌通用引物（ITS1、ITS4，ITS4、ITS5）PCR擴增的產物，用1%瓊脂糖電泳檢測，500～750bp間有明顯的擴增條帶，且ITS1、ITS4產物長度稍小于ITS4、ITS5（圖3a，泳道5～8）。進一步對ITS4、ITS5產物進行克隆測序后顯示其長度為595bp。按1.5中的方法進行進化分析。盡管本試驗中所測序列有單個核苷酸的差異（以ITS5－1，6和10三個代表克隆），但均屬于A.alternata類群（圖3b）

圖3 病菌5.8SrDNA基因及其側翼ITS序列的檢測以及鏈格孢屬不同種的進化分析Fig.3 Detection and phylogeny analysis of 5.8SrDNA gene and flanking ITS sequence

2.4 遺傳群體F2∶3家系中葉枯病表型鑒定以及抗病基因的遺傳特性分析

用本實驗室分離的具有致病性的病原菌，在實驗室條件下接種母本‘JIC106003’和父本‘JIC106007’以及252個F2∶3家系小麥，按1.6中的方法對病級進行了分類。在群體中植株表現為抗病的有64株系（圖4a，e），中抗的有128株系（圖4b），中感的有51株系（圖4c），感病的有8株系（圖4d）。

圖4 F2∶3家系中抗病性鑒定的表型特性以及AUDPC分布Fig.4 Different resistant phenotype to the pathogen among F2∶3family lines and the distribution of the AUDPC in F2∶3family lines

AUDPC分析表明，親本‘JIC1060003’AUDPC為839.98，表現為中等抗病；‘JIC1060007’AUDPC為2592，表現為高感，F1單株的AUDPC平均983.58（2009年數據），與F2∶3家系平均數928.41接近。根據F1的表型，初步推測親本‘JIC106003’中的抗性基因為顯性基因。F2∶3家系中的AUDPC分析表明（圖4e），部分株系表現為超親抗性（如67株AUDPC為0～500，小于抗性親本‘JIC1060003’），且抗性呈現偏態分布，以抗、中抗偏多。在F2：3家系中，以抗和中抗的株系數（193）對中感和感病的株系數（59，部分株系的AUDPC值接近1 500，表現為中感），χ2為0.256，符合一對性狀分離規律 （P＞0.05，小于＝3.84），因此認為該親本組合中存在一對主效的顯性抗病基因。同時由于群體中的抗性存在超親個體，因此雙親中可能還存在作用較小的數量性狀和隱性的抗病基因，只有這些基因在后代中聚合且與抗性顯性基因一起時才表現為超親抗性。

3 討論

本研究應用葉片病斑的形態觀察，孢子形態顯微觀察、科赫氏法則以及分子進化分析等試驗方法，證明了一株與鏈格孢屬的Alternaria alternata較為接近的真菌是參試野生二粒小麥葉枯病的致病菌，并通過遺傳學分析，表明抗病親本‘JIC106003’親本攜帶一對主效抗病基因，同時雙親中還可能存在數量性狀和隱性的抗病基因。

有關小麥鏈格孢葉枯病，我國研究者［4］認為多種鏈格孢菌能引起葉枯病癥狀，并從菌絲和孢子的形態上進行了描述。在國際上，Vergnes等［9］從小麥上分離到的4種鏈格孢菌A.triticina、A.alternata、A.tenuissima 和A.arborescens，只有 A.triticina能引起少數四倍體硬粒小麥的葉枯病，盡管該菌曾經在20世紀60－70年代在印度引起大面積葉枯病，但后來的栽培品種對該菌都能免疫。該研究同時通過ITS1、5.8SrDNA和ITS2區序列比較對上述4個種進行了分子進化分析，來自A.triticina的序列與其他3種有明顯區分，其他3種序列也能各自聚類，說明能用該區的序列區分上述4種鏈格孢菌。因各地環境條件的差異，本試驗首先按照科赫氏法則嚴格進行了病原菌的分離、再接種與再分離和再接種等試驗環節，證明了所分離的菌種確實引起供試品種的葉枯病癥狀，且通過兩次PCR擴增ITS1、5.8SrDNA和ITS2區域進行克隆測序，序列相似性99.9%以上，證明了所獲得的菌落是單菌落。根據Vergnes等［9］提交的序列，本研究中分離的鏈格孢序列屬于A.alternata類群（圖3b）。因Vergnes等［9］只提交了4種小麥鏈格孢菌株的序列，而王洪凱等［11］對多種鏈格孢屬種的研究認為，ITS1、5.8SrDNA和ITS2區域序列無法在種的水平上對鏈格孢屬進行區分，因此本研究分離的菌株與Vergnes等的A.alternata供試菌株的區別尚待進一步研究。

通過在實驗室可控條件下接種小麥葉片，表現出的病情排除了自然環境條件不穩定的因素，試驗獲得的數據更能接近基因型的實際表現。經過F1和F2：3家系病情分析，表明抗A.alternata葉枯病基因較為復雜，存在主效顯性抗病基因的同時還存在微效抗病基因，且可能以隱性的方式存在。為了進一步鑒定抗病基因的遺傳規律，回交群體的創制正在進行中。

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