對甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株篩選

郭 靖， 周子珊， 蔡吉林， 惠識瑤， 張 杰， 高繼國， 束長龍＊

（1.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

甜菜夜蛾［Spodoptera exigua（Hübner）］屬于鱗翅目夜蛾科，是一種間歇性暴發為害的農業害蟲。隨著農業種植結構改變和受全球氣候持續變暖因素的影響，其對蔬菜、棉花等經濟作物造成嚴重的危害，并呈逐年上升趨勢［1］。由于化學殺蟲劑濫用而造成諸多負面影響，生物農藥逐漸受到了全球的關注與重視［2］。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt）自1938年產業化以來成功發展為目前全球應用最廣的微生物殺蟲劑，在害蟲的防治中起到了越來越重要的作用［3－5］。目前國外商業化的Bt殺蟲劑主要有 Agree、Biobit、Condor、Cutlass、Dipel、Full－Bac、Javelin、Xentari等，這些產品所含有的晶體蛋白，主要是以B.thuringiensis subsp.kurstaki亞種（Btk）HD－1等菌株為主所產生的Cry1類或Cry2類蛋白［6］；其中對甜菜夜蛾有較好殺蟲活性的商業化殺蟲劑包括Agree和Xentari等。我國在防治夜蛾科害蟲的蘇云金芽胞桿菌研究和應用方面也取得了一定成效，鄭大勝等從3 100株野生型Bt菌株中篩選到對甜菜夜蛾高毒菌株13株［7］。牛桂蘭［8］、金大勇［9］等分別篩選獲得了對甜菜夜蛾等害蟲高效的Bt菌株。但是，目前國內用于防治甜菜夜蛾的Bt產品生產的菌株數量有限，其中武漢科諾公司的KN11菌株已經成功產業化十余年。

作者從本實驗室分離的Bt菌株中篩選對甜菜夜蛾具有高毒力的菌株，獲得了一株與生產菌株KN11毒力相當的菌株，并進行了殺蟲基因鑒定和毒素蛋白的分析，為新型Bt殺蟲基因分離克隆與制劑的開發應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株來源

陽性對照菌株KN11為武漢科諾生物科技股份有限公司惠贈；G03菌株為實驗室保存。

Bt分離株菌株為本實驗室從國內采集的土壤中分離獲得，完成了形態學觀察和初步的生物活性測定。

1.1.2 培養基

液體LB：1% 胰蛋白胨，0.5% 酵母提取物，1%NaCl，pH 7.0，15磅滅菌20min。

牛肉膏蛋白胨培養基：3% 牛肉膏，5% 蛋白胨，pH 7.0，15磅滅菌20min。

1.1.3 試蟲人工飼料及試蟲來源

甜菜夜蛾試蟲飼料由中國農業科學院植物保護研究所棉花害蟲組提供；

甜菜夜蛾由武漢科諾生物科技股份有限公司提供。

1.1.4 生化試劑

引物由上海生工生物公司合成，Taq酶等PCR擴增試劑購自TaKaRa公司，其他試劑均為市售國產或者進口分析純或電泳級純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計

菌株篩選引物設計：通過文獻檢索，確定對夜蛾科害蟲具有高活性的cry基因有：cry2A、cry9、cry1B、cry1C［10］、vip3A［11］、cry1Ea［12］；分 別 將 這 6種基因進行聚類分析，在保守區設計特異性引物，并對本實驗室保存的192株對鱗翅目具有高活性的Bt菌株進行篩選。

采用PCR－RFLP的方法對cry1A 基因型進行鑒定；鑒定方法參照文獻［13］。

幾丁質酶基因鑒定引物設計：收集GenBank中Bt的幾丁質酶序列，聚類分析后設計鑒定引物。cry基因特異性鑒定引物及幾丁質酶基因鑒定引物見表1。

表1 PCR鑒定引物及其序列Table 1 PCR primer sequences

1.2.2 蘇云金芽胞桿菌質粒圖譜分析

提取Bt菌株的大質粒，并進行電泳分析。大質粒提取方法、電泳方法參見文獻［14］。

1.2.3 蘇云金芽胞桿菌晶體類型觀察

電鏡樣品制備：將Bt菌株在1／2LB平板上劃線培養，30℃培養36h（約50%產生晶體）。收集菌體，滅菌水洗3次，12 000r／min離心10min收集芽胞和晶體的混合物。將沉淀懸浮在1mL滅菌水，混勻后，取少量菌液均勻涂于1cm2薄玻璃片上，晾干備用。

電鏡觀察：離子濺射噴金（2nm），掃描電鏡觀察。

1.2.4 蘇云金芽胞桿菌菌株晶體蛋白SDS－PAGE分析

Bt菌株菌粉SDS－PAGE分析方法：取0.1g菌體，1mol／L NaCl洗，滅菌水反復洗3次，取處理后的樣品100μL，加入25μL 0.5mol／L的NaOH，室溫反應5min，加入5×Loading Buffer混勻，dd H2O補齊體系至200μL，100℃煮5min，12 000r／min離心5min，吸取上清液進行加樣，進行SDSPAGE分析；以牛血清白蛋白（BSA）為標準計算菌粉的胞晶含量。

1.2.5 蛋白條帶的質譜鑒定

SDS－PAGE電泳分析后，考馬斯亮藍R－250染色分析蛋白條帶，并小心切取所有蛋白條帶分裝于Ep管中，送往北京華大蛋白質研發中心有限公司進行質譜分析。

1.2.6 蘇云金芽胞桿菌生長曲線的測定

菌種活化：接種蘇云金芽胞桿菌于5mL液體LB培養基中，過夜培養。

生長曲線測定：將過夜培養物轉接到100mL牛肉膏蛋白胨培養基中（1%的接菌量），30℃，220r／min條件下培養，每1h測定A600值，重復3次，繪制出菌株的生長曲線。

1.2.7 蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因的檢測

以Bt菌株總DNA（實驗室保存）為模板，kchi5和kchi3（表1）為鑒定引物，利用PCR的方法對Bt菌株幾丁質酶基因進行鑒定。

擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，30個循環；72℃延伸，10min。

1.2.8 室內殺蟲活性測定

樣品制備：挑取單菌落于5mL液體LB培養基中，30℃220r／min培養12h后，轉接于200mL液體牛肉膏蛋白胨培養基中（1% 接菌量），30℃220r／min，培養至裂解產生晶體后（50% 以上），離心收集菌體，冷凍干燥－70℃保存備用。

甜菜夜蛾生物活性測定：生測樣品準備同上，放入24孔板后晾置，每孔接初孵齡幼蟲1頭，每個處理3次重復，25℃，培養7d后調查死、活蟲數，并觀察幼蟲取食情況，計算校正死亡率［15］。LC50值測定梯度設置（1.0mg／mL，按照3倍梯度稀釋，1／3倍，1／9倍，1／27倍，1／81倍，1／243倍）。

1.2.9 數據分析

采用POLO軟件計算LC50值［16］，待測樣品與陽性對照的LC50的比較采用成組法t檢驗（Independent two samples t test），P＜0.05為差異顯著，所有統計分析在SPSS 16.0軟件中進行。

2 結果與分析

2.1 Bt菌株的cry基因篩選

利用所設計的特異性引物（表1）對本實驗室保存的192株對鱗翅目具有較高殺蟲活性的Bt菌株進行篩選，得到15株基因型豐富的Bt菌株（表2）。

表2 分離菌株cry基因篩選表1）Table 2 Screening table for isolating crygene

2.2 Bt菌株的大質粒圖譜分析

提取篩選的15株Bt菌株的大質粒，電泳分析結果顯示：15株Bt菌株可分為8種類型。如圖1所示：其中 PS8－B2、PS4－C9、PS3－C5和 PS3－C2同屬于一種類型；PS1－G3、PS1－F3、PS1－G6、PS1－G7和 SCLB3同屬于一種類型，其余6種菌株各不相同。

圖1 Bt菌株質粒圖譜分析Fig.1 Plasmid profile of Bt strain

2.3 Bt菌株晶體類型觀察

對8種類型的代表菌株進行晶體類型觀察，這8株菌株中含有的晶體類型包括雙錐體形、球形、方形等（圖2）。

2.4 殺蟲晶體蛋白的SDS－PAGE分析

通過SDS－PAGE分析了8株Bt菌株所表達的Cry蛋白（圖3）。其中菌株PS1－F11和SCL－B3既表達130ku的蛋白又表達60ku左右的蛋白，PS8－B11同時表達130ku和70ku左右的蛋白，其余菌株均表達130ku左右的蛋白。

電泳圖片用ImageJ（v1.43）軟件進行定量分析，各菌株發酵后的胞晶混合物中晶體蛋白含量定量分析結果見表3。

2.5 生物活性測定

菌株對甜菜夜蛾的初篩結果顯示：菌株PS3－C2和PS1－F11與陽性對照G03和KN11校正死亡率（1.0mg／mL和5.0mg／mL時）接近，因此選擇這兩株菌株進行甜菜夜蛾致死中濃度的測定。

表3 菌株胞晶混合物殺蟲晶體蛋白含量Table 3 Contents of insecticidal proteins in bacterial cell crystal mixtures

表4 Bt菌株對甜菜夜蛾初孵幼蟲的生物活性初步測定Table 4 Preliminary bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

根據菌株蛋白定量計算出的胞晶含量計算出晶體蛋白的致死中濃度。生物活性測定結果表明，菌株PS3－C2與KN11活性相當，且與對照菌株KN11在P＜0.05水平上差異不顯著。

在菌株干粉水平上，菌株PS3－C2對甜菜夜蛾表現出很好的殺蟲活性；在計算為蛋白含量時菌株PS3－C2同樣表現出了很好的殺蟲活性，有的菌株雖然胞晶含量較高，但是，相比之下殺蟲活性并不高；所以綜合各因素，菌株PS3－C2具有比較好的應用前景。

2.6 蘇云金芽胞桿菌生長曲線的測定

通過生長曲線的測定，對8株菌株在牛肉膏蛋白胨培養基中的生長特性進行比較，結果表明：在牛肉膏蛋白胨培養基中，各菌株的生長速度差別不大（圖4）。

表5 Bt菌株對甜菜夜蛾初孵幼蟲的生物活性測定Table 5 Bioassay of Bt strains against newly hatched larvae of S.exigua

圖4 菌株生長速率比較（牛肉膏蛋白胨培養基）Fig.4 Growth rate of different Bt strains

2.7 蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶基因及其活性檢測

利用鑒定引物（表1）對8株Bt菌株幾丁質酶基因進行PCR檢測，電泳結果表明：這8株菌株在2 000bp左右均有明顯的擴增條帶，且擴增條帶大小為2 030bp（圖5），說明這8株菌株中均有幾丁質酶基因的存在。

2.8 蛋白質譜分析

根據生物活性數據結果顯示（見表5），菌株PS3－C2對甜菜夜蛾具有很好的殺蟲活性，通過SDSPAGE分析對這株菌株進行了蛋白質譜的分析，結果表明，菌株PS3－C2內含有Cry1C蛋白。

圖5 菌株幾丁質酶基因PCR檢測結果Fig.5 PCR amplification of bacterial chitinase gene

表6 質譜分析結果Table 6 Mass spectrum analysis

3 討論

Bt作為一種與環境友好的微生物殺蟲劑，具有巨大的應用前景，在綠色植保中占有重要的地位［17－18］。本研究從192株對鱗翅目害蟲有活性的菌株中，篩選出3株對甜菜夜蛾具有較強毒殺作用的菌株，發現PS3－C2菌株與目前國內生產菌株KN11毒力相當。同時進行了晶體形態特征、SDS－PAGE、生長曲線、幾丁質酶和殺蟲蛋白基因鑒定等研究，這些結果為新的Bt基因分離克隆和殺蟲劑的開發奠定了基礎。

Bt菌株的殺蟲活性高低與其所含有的殺蟲基因密切相關，經過基因鑒定，本研究獲得的對甜菜夜蛾高毒力的菌株PS3－C2中含有對甜菜夜蛾高毒力的cry1C基因［19］，蛋白質質譜分析結果證實該菌株能表達Cry1C蛋白，從分子水平證明了該菌株高毒力的成因。

本研究通過PCR的方法鑒定了菌株中的幾丁質酶基因，發現8株菌株中均含有幾丁質酶基因。據林毅等報道幾丁質酶具有增強殺蟲晶體蛋白殺蟲效果的作用［20－21］，幾丁質酶在Bt殺蟲作用中扮演著重要角色，重視這個毒力因子的作用，將為新一代Bt產品的研發提供更多的選擇。

以往評價Bt菌株殺蟲效果多以發酵液和干粉直接進行計算。而不同菌株的生物學特性差異很大，其發酵液和干粉中殺蟲晶體蛋白的含量差異更大，僅以發酵液的倍數或干粉的質量來計算生測數據，菌株之間的可比性不大。本研究采用NaOH溶解方法對發酵干粉中殺蟲晶體蛋白進行定量，測算出晶體蛋白的LC50，這種方法上的改進能夠更加準確地評價菌株的殺蟲活性，篩選出真正高毒力的菌株。

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