血清 HMGB1、MIF、IL－6水平在川崎病患兒中的臨床意義

李艷飛，金蓮花，楊思睿，樸金花

（吉林大學白求恩第一醫(yī)院，吉林 長春130021）

川崎?。↘awasaki Disease，KD）是一種好發(fā)于5歲以下兒童的全身性非特異性血管炎。本病在世界范圍內均有發(fā)現(xiàn)，以亞洲地區(qū)發(fā)病率最高。其病變主要累及冠狀動脈，若未經治療，20%－25%的患兒發(fā)生冠狀動脈損傷（coronary artery lesion，CAL）或冠狀動脈瘤［1］，由于KD臨床表現(xiàn)不典型、癥狀出現(xiàn)順序及嚴重程度不同，為臨床診斷及治療帶來了困難，尤其是無反應性丙種球蛋白（IVIG）的患兒出現(xiàn)，所以KD成為小兒后天獲得性心臟病的主要原因。本組實驗通過檢測川崎病住院患兒外周血清HMGB1、MIF、IL－6水平的變化，分析 KD有關病理機制，探討三組因子與KD、冠狀動脈病變及其丙種球蛋白無反應性的關系。

1 對象與方法

1.1 對象 （1）實驗組（n＝52）：為2009年1月－2010年5月在我科住院的患兒，其中男30例，女22例，年齡5個月－6.3歲，平均年齡（2.56±1.77）歲，中位數為2歲。KD診斷標準使用第7次世界小兒KD研討會修訂的標準［2］，所有患兒病程在5－15天內，入院前未接受過靜脈丙種球蛋白、阿司匹林及激素治療。52例患兒全部于急性期行超聲心動圖檢查：32例合并CAL。（2）發(fā)熱對照組（n＝40）：為同期住院的非KD的發(fā)熱性疾病患兒，呼吸道感染27例，泌尿道感染13例，其中男25例，女15例，平均年齡（2.43±1.56）歲。（3）正常對照組（n＝37）：為同期在本科門診體檢的健康兒童，其中男21例，女16例，平均年齡（2.47±1.54）歲，排除炎癥性疾病，化驗檢查未見異常。3組兒童在年齡、性別具有可比性。

同時，根據IVIG無反應性KD的定義，初治IVIG治療無效，治療36小時以后仍有發(fā)熱，體溫超過38.5℃，將川崎病組分為IVIG敏感組（n＝41）與IVIG無反應組（n＝11）。

1.2 標本采集 所有實驗組患兒于急性期（入院24小時內靜脈丙種球蛋白及阿司匹林治療前）取靜脈血3ml，于病程2周后恢復期（臨床癥狀逐漸消失、血沉、C－反應蛋白恢復正常），取同量血1次。所有標本經離心機分離血清，冷凍于－80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。發(fā)熱對照組于發(fā)熱前、熱退后采血，正常對照組采血1次，標本處理方法與實驗組相同。

1.3 HMGB1、MIF、IL－6的檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附檢測法（ELISA）測定，試劑盒為北京博奧森公司產品（HMGB1）及北京鼎國公司（MIF、IL－6），靈敏度為0.01ng/ml。

1.4 統(tǒng)計學方法 計數資料分析采用n和所占百分比（%），計量資料用中位數或±s表示，均數差異比較采用t檢驗或單因素方差分析。數據由SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理，組間比較采用F檢驗，相關分析用相關系數r表示。P＜0.05示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 三組血清中 HMGB1、MIF、IL－6水平的比較

川崎病組急性期、恢復期患兒血清HMGB1、MIF、IL－6水平較正常對照組明顯增高（P＜0.05），且在急性期增高更為顯著，SNK法兩兩比較提示：KD患兒急性期與恢復期HMGB1、MIF、IL－6值比較明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），川崎病患兒急性期與發(fā)熱對照組（急性期）、正常對照組比較亦明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.2 川崎病急性期合并CAL與NCAL患兒HMGB1、MIF、IL－6水平的比較

急性期KD患兒CAL組與NCAL組相比較，有CAL組HMGB1、MIF、IL－6三組因子在血清中含量均較NCAL組中明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。同時經SPSS相關分析顯示，KD組患兒急性期HMGB1、MIF、IL－6含量與冠狀動脈擴張程度呈正相關，相關系數和P值分別為（r＝0.928，0.964，0.964，P＜0.05），有直線相關關系。

表1 三組血清HMGB1、MIF、IL－6水平的比較

表2 川崎病急性期CAL組與NCAL組HMGB1、MIF、IL－6水平的比較（ng/ml）

2.3 川崎病急性期IVIG敏感與無反應性IVIG患兒 HMGB1、MIF、IL－6水平的比較

IVIG無反應組KD患兒HMGB1含量與IVIG敏感組相比顯著增高，二者有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但兩組 MIF、IL－6的含量在IVIG無反應 KD組有所增高，未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 川崎病急性期IVIG敏感組與無反應IVIG組HMGB1、MIF、IL－6含量的比較（ng/ml）

3 討論

HMGB1在1999年由 Wang［3］等人首次發(fā)現(xiàn)，作為一種晚期炎性介質參與膿毒癥的發(fā)病過程。HMGB1廣泛存在于高等生物細胞核內的非組DNA結合蛋白，是維持核小體穩(wěn)定、調控基因復制、重組、轉錄等過程中不可缺乏的調控蛋白。在各種急性炎癥條件下，HMGB1可在細胞外或胞漿中表達，HMGB1釋放到細胞外通過2種方式：機械損傷和壞死的細胞可將核內HMGB1釋放至細胞外誘導炎性反應和受損細胞與巨噬細胞聯(lián)合培養(yǎng)可致巨噬細胞核轉錄因子－κB（NF－κB）核內轉移，稱活化的單核巨噬細胞主動“分泌”［4］。Kagi T.A［5］的實驗給小鼠注射LPS、IL－1、TNF－α等炎性介質后，單核巨噬細胞開始分泌HMGB1，而且在隨后的24h內血清HMGB1濃度可維持較高水平；同時，HMGB1也可刺激單核巨噬細胞分泌某些促炎因子，如TNF－α、IL1、II6、IL8，但不包括 10和 12。實驗表明，HMGB1引起的TNF－α分泌曲線呈明顯的雙峰型，峰值分別出現(xiàn)在3h和8～10h，故在延長和維持炎性反應中，HMGB1起重要作用。人體檢測也發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患兒血清HMGB1水平較正常對照組升高，且升高的程度與感染程度呈正相關。HMGB1在中樞神經系統(tǒng)中可起到一種內生性致熱源的作用，介導中樞的炎性反應：當細胞壞死或受損時，核內的HMGB1可釋放到胞外，引發(fā)單核巨噬細胞分泌促炎因子；而促炎因子又反過來促HMGB1的分泌，在炎性反應的后期，這種正反饋效應對炎性反應的維持起到了相當重要的作用。此機制可能在川崎病的發(fā)生發(fā)展中有相當重要的意義。上述機制在本實驗顯示川崎病患兒血清HMGB1較正常健康患兒增高，且差異有統(tǒng)計學意義。在急性期水平明顯升高，恢復期有所下降（P＜0.01），可能與 HMGB1晚期炎性作用未完全消失有關。Fiuza研究顯示［6］，重組人 在與微血管內皮細胞共同孵孕下，HMGB1能增加ICAM－1、VCAM－1和 RAGE含量的表達；促使 TNF、MCP－1、IL－8、PAI－1和t－PA 分泌；MAP激酶、ERK激酶、JNK激酶磷酸化，核轉錄因子NF－κB和Sp1發(fā)生核移位，影響血管內皮細胞的正常功能。本實驗結果顯示CAL組HMGB1高于NCAL組，差異有統(tǒng)計學意義，表明KD冠狀動脈損傷組炎性反應明顯，血管內皮細胞損傷嚴重。相關分析結果提示HMGB1水平與冠狀動脈擴張有一定的相關性，且在恢復期這一狀態(tài)尚不能完全改善，這可能與HMGB1對心血管系統(tǒng)的炎性損傷和對纖溶凝血系統(tǒng)的影響以及晚期促炎作用相一致。在KD治療中，由于早期大劑量丙種球蛋白在臨床中的應用，使該病在心血管并發(fā)癥上得到了有效地控制，但是，仍有部分患兒應用1個療程的IVIG，36小時后仍有發(fā)熱，體溫超過38.5℃者為IVIG無反應性KD，也成為IVIG抵抗性KD。對于KD急性期，預測IVIG敏感性KD與無反應性KD的研究中，許多學者為了尋找一種理想的指標，經過大量臨床資料、實驗室指標及細胞因子的實驗，均未得到滿意的結果。2009年Taisuke E［7］的臨床試驗表明，在 WBC、PLT、CRP、AST、ALT、TNFα、IL－1β、IL－6、IL－8、IL－10等指標中，IVIG 無反應性 KD 患兒中HMGB1的含量明顯增高，可能成為預測IVIG無反應性KD的顯著指標，且國外Kobayashi等人也證實HMGB1水平在KD靈敏度達86%，特異性達68%［8］。本實驗中，6名IVIG無反應性 KD患兒HMGB1水平較敏感組顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義。故在KD患兒急性期，HMGB1有望成為檢測IVIG無反應性KD的一種潛在工具。

MIF是一種含有115個氨基酸殘基的蛋白質，在活化的T淋巴細胞及許多組織細胞都可以產生和表達MIF。當機體受到微生物代謝產物或其它前炎癥細胞因子刺激或發(fā)生直的抗原特異性反應時［9］，T、B淋巴細胞、腺垂體細胞及單核巨噬細胞等釋放大量MIF，MIF不僅有抑制巨噬細胞游走、黏附、吞噬和聚集的功能，還促進其在炎癥局部浸潤、增生、激活及通過調節(jié)細胞信號轉導，促進某些細胞因子表達，分泌細胞因子，如IL－1β、IL－6、8、TNF－α和IFN－γ，同時使一氧化氮（NO）釋放增加和磷脂酶A2表達增強，進而產生促炎作用［10］。Leng等［11］研究發(fā)現(xiàn)，CD74可能是MIF的膜受體，MIF通過與細胞膜表面蛋白CD74細胞外基團結合而發(fā)揮作用。MIF與CD74分子的胞外部分，即73－232位氨基酸殘基高親和力基團結合后，激活細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）磷酸化級聯(lián)反應，引起各種細胞的增生及炎性遞質的合成與釋放，產生各種生理效應，故2種抗CD74抗體（LN2或M－B741）可明顯阻抑MIF的上述作用。CD74胞外部分的可溶性片段sCD7473－232及抗CD74中和性抗體均可抑制細胞膜上的CD74分子與MIF結合，從而阻抑MIF的促炎作用。本實驗中，KD患兒血清MIF水平明顯升高，尤以急性期為著（P＜0.05），且高于發(fā)熱對照組，差異有顯著性（P＜0.05），說明 MIF在KD的發(fā)生過程中起重要作用，同時Lee等研究也發(fā)現(xiàn)，KD急性期患兒血清MIF水平明顯升高，在恢復期有所下降，差異具有顯著性，可能和KD的發(fā)病機制有關［12］。MIF還與許多心血管疾病有密切聯(lián)系，早期頸動脈粥樣硬化斑塊和粥樣硬化動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，MIF的表達水平與血管內膜中層增厚和脂質沉積增加顯著相關［13－15］，Pan等 學者［16］發(fā) 現(xiàn) 低 密 度 脂 蛋 白受體缺陷小鼠的MIF編碼基因缺失，可以防止飲食導致的動脈粥樣硬化斑塊形成；在急性心肌梗死小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，梗死區(qū)域邊緣存活的心肌細胞數目與巨噬細胞中MIF的表達水平呈正相關［17］；在對基質膠原檢測中發(fā)現(xiàn)，通過活化MAPK和磷脂酰肌醇－3激酶，MIF可以介導遷移和血管管腔形成，誘導血管生成。本實驗結果顯示CAL組MIF高于NCAL組，差異有統(tǒng)計學意義，表明KD冠狀動脈損傷組炎性反應明顯，血管內皮細胞損傷嚴重，相關分析結果提示MIF水平與冠狀動脈擴張有一定的相關性，說明，MIF通過損傷血管內皮系統(tǒng)，參與了KD患兒冠狀動脈損傷機制。但本研究在IVIG無反應性KD與IVIG敏感組相比，差異無顯著性，可能與IVIG組僅有6例樣本有限有關，尚需進一步增加樣本，繼續(xù)觀察。

IL－6是一種作用廣泛的細胞因子，主要由T細胞、單核細胞，成纖維細胞、肉皮細胞和角化細胞等產生，具有多種生物活性，是機體復雜的細胞因子網絡中的一個重要成員，IL－6通過識別靶細胞表面的低親和力受體hIL6R，進而與其高親和力受體gp130相結合形成三聚體復合物，經細胞內信號轉導途徑而發(fā)揮多種生物學效應。它可促進B細胞分化、免疫球蛋白的分泌和再次免疫應答；促進細胞毒性T淋巴細胞分化，協(xié)同IL－2增強細胞毒性T淋巴細胞中穿孔素基因的表達，并增加T細胞IL－2產生和IL－2R表達。同時促進并調節(jié)了諸如免疫系統(tǒng)、造血系統(tǒng)、炎癥反應中多種細胞的增殖和分化。本研究中KD患兒血清IL6水平明顯升高，尤以急性期為著（P＜0.05）?；謴推谄渌矫黠@下降，且高于發(fā)熱對照組，差異有顯著性（P＜0.05）。提示KD急性外周血中活化的T細胞及單核巨噬細胞增殖，分泌高濃度的細胞因子，在免疫反應及炎癥反應中發(fā)揮重要作用。CAL組IL－6高于NCAL組，差異有統(tǒng)計學意義，表明KD冠狀動脈損傷組炎性反應明顯，血管內皮細胞損傷嚴重，相關分析結果提示IL－6水平與冠狀動脈擴張有一定的相關性，因此對高IL－6水平的患兒應注意有無冠狀動脈擴張等病變的存在，并注意監(jiān)測其變化，防止冠狀動脈瘤的發(fā)生［18］。近年又認為細胞凋亡減少可能與某些自身免疫性疾病的發(fā)生關聯(lián)［19］。因此推測IL－6可能是導致KD免疫紊亂產生冠狀動脈病變的重要因素。國內有研究［20］發(fā)現(xiàn)小兒冠狀動脈內徑與IL－6的水平成正相關，提示IL－6水平越高，對冠狀動脈損害導致冠狀動脈擴張或瘤形成的可能性越大。因此，我們認為監(jiān)測KD患兒血清IL－6的水平，有助于對KD患兒病程發(fā)生發(fā)展的監(jiān)測，進一步評估患兒的免疫狀況，為KD早期診斷提供客觀依據。同時，本研究在IVIG無反應性KD與IVIG敏感組的實驗中，未發(fā)現(xiàn)IL－6與IVIG無反應性的關系，差異無顯著性。因此，IL－6在KD發(fā)病及并發(fā)癥的產生方面仍有許多問題值得研究探討。

本研究探討了KD患兒發(fā)病急性期和恢復期血清 HMGB1、MIF、IL－6 含 量 的 變 化，我 們 認 為HMGB1、MIF和IL－6細胞因子參與KD的病理生理過程，細胞因子的級聯(lián)放大效應是非特異性血管炎性損傷的基礎，可望作為KD患兒急性期的一個判斷指標，特別是HMGB1有望成為檢測IVIG無反應性KD的一種潛在工具。在川崎病早期進行治療，以期減少冠狀動脈后遺癥的機率。

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