低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區序列分析

計玉仙，張志明，李建平，姜小建，肖改娥，馬 瑩，舒 放，姜立茹，王 鑫

（西安市中心醫院 檢驗科，陜西 西安710003）

乙型病毒性肝炎是一種嚴重影響人類健康的危害性疾病，目前全球至少約有3億乙型肝炎病毒攜帶者，感染乙型肝炎病毒可引起不同程度的急、慢性肝臟疾病［1］，近年來由于乙型病毒性肝炎疫苗、高效價免疫球蛋白以及抗病毒藥物的廣泛應用，造成部分乙型肝炎病毒表面抗原變異呈低水平表達［2］，臨床上乙型肝炎病毒表面抗原含量大于0.15μg/L而小于5μg/L定義為低水平乙型肝炎病毒表面抗原，其成因較多［3］，本文就37例低水平乙型肝炎病毒S區特征進行初步研究和探索，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源

選取西安市中心醫院2010年5月－2012年8月間門診及住院37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者，年齡23－64歲，平均年齡41±19歲，其中男18例，女19例，多次檢測者只取首次資料，待測標本放置－20℃保存。

1.2 引物設計 根據美國GeneBank公布的HBV全基因序列，在S區設計兩條引物，內引物Primer Pair1正 向 5’－TGTTTGCTGTACAAA－3’，反 向5’－TGGGAGTGGGCC－3’，外引物Primer Pair2正向 5’－TCACTACCAGCACG－3’， 反 向 5’－TCAGTTTACTAGT－3’引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.3 主要試劑與儀器 PCR Premix、Loading Buffer、Lysis Buffer（寶生物工程大連有限公司）、瓊脂糖（BBI公司）、DL2000DNA Marker（MBI公司）、UNIQ－10核酸純化柱（上海生工生物工程技術服務有限公司）、化學發光試劑盒（鄭州安圖綠科生物工程有限公司），HBsAg中和確認試劑盒（珠海麗珠試劑股份公司）、HBsAg標準物質2μg/L購自康徹思坦生物公司。鄭州安圖綠科生物工程有限公司LUMO－Autobio化學發光儀、美國應用生物公司ABI7300基因擴增檢測儀、北京六一DYY－2C電泳儀、美國應用生物公司ABI3730測序儀。

1.4 方法

1.4.1 低水平HBsAg篩查及確認 采用酶聯免疫ELISA法和化學發光法檢測HBsAg并用HB－sAg中和試驗進行確認［4］。

1.4.2 HBV－DNA模板的提取 取100μL血清加入等量DNA濃縮液震蕩5s，12 000r/min離心10 min，去上清，沉淀中加入20μl DNA提取液，劇烈震蕩5－10s，瞬間離心數秒，100℃金屬浴處理10 min后12 000r/min離心5min。上清液2μl作為1st PCR的模板。

1.4.3 PCR 反應條件 （1）1st PCR反應 在PCR反應管（0.5ml）中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反應管中加入2μl已處理好的標本和10.5μl的Primer Pair 1，高速離心數秒。按以下條件進行1st PCR反應94℃ 預變性1min，92℃變性30sec，55℃退火30s，72℃延伸5min共30個Cycles（2）2nd PCR反應 在PCR反應管0.5ml中加入2×PCR Premix 12.5μl，再向此反應管中加入2μl的1st PCR擴增液和10.5μl的Primer Pair 2，高速離心數秒，按以下條件進行2nd PCR反應92℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸7min共35個Cycles。

2 結果

2.1 電泳結果判定 向2nd PCR擴增液中加入5 μL的6×Loading Buffer，混勻后取10－15μL進行2%的瓊脂糖凝膠電泳。PCR擴增液在230bp附近有DNA亮帶，則此標本也可以判定為陽性（相當于HBsAg陽性）；如果2nd PCR擴增液在230bp附近沒有DNA亮帶，則此標本可判定為陰性。Control實驗時，2nd PCR擴增液在350bp附近有DNA亮帶（圖1）。

圖1 PCR擴增產物電泳結果

2.2 HBV血清學分型判定

HBV的血清學分型是由HBsAg第122個和第166個氨基酸是賴氨酸（或精氨酸來決定的。而實際上是由下述框中的DNA堿基（A或G）來決定的，決定d/y的堿基：（A－－d，G－－y）；決定r/w 的堿基：（A－－w，G－－r）。用2nd PCR擴增產物進行 DNA序列測定，測序結果（圖2）按照以下標準（圖3）判斷其乙肝病毒的亞型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）。

37例低水平乙型肝炎病毒表面抗原標本中，成功擴增并測序32份，其余5份擴增產物因不滿足測序要求（沒出現目的條帶或條帶質量不高）無法進行S區序列分析，32份成功測序標本經經美國國立醫學圖書館中Genotyping在線分析，B型20例（62.5%，20/32），C 型12例（37.5%，12/32），與 Gene－Bank中收錄的AF100309、AB014381參考序列同源性最高；血清學分型18例為adr，10例為adw，3例為ayw，1例為ayr，并發現21例S區核酸序列發生 點 突 變，突 變 率 為 （65.6%，21/32）分 別 為A514C、T562A 、G587A、A589C各1例，G508A、G509A、A529G、T531C、T581A 各 2 例，3 例G511A、4例G508C。

3 討論

圖2 低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區測序結果

圖3 乙肝病毒血清學分型（Adw、Adr、Ayr及Ayw）判定標準

乙型肝炎病毒簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，主要分為A－H 8個基因型，由于基因型分布與地域和人群密切相關，國內學者對各地HBV基因型分布已進行了廣泛研究，2011年王林川［5］等對西安地區348例乙肝患者分型表明HBV B基因型87例（24.2%）；C型233例（64.7%）；B＋C混合型2例（0.56%），未檢出 A、D、E、F、G、H 型，與本文32份該地區低水平乙型肝炎病毒B型20例（62.5%，20/32），C型12例（37.5%，12/32）研究群體有明顯差異（P＜0.01）。

HBsAg是乙肝病毒包膜的主要蛋白，HBsAg有一個特異的共同抗原決定簇“a”和至少兩個亞型決定簇“d/y”和“w/r”，根據其抗原性的不同主要分為4個血清型（HBsAg的亞型）即Adw、Adr、Ayr、Ayw，最常見的血清型為Adw、Adr和ayw，我國絕大數地區以Adr為主，Adw次之，新疆、西藏、內蒙古［6－8］等自治區的本地民族幾乎全為Ayw。32例低水平乙型肝炎經血清學分型18例為Adr，10例為Adw，3例為Ayw，1例為 Ayr，血清型分布與一般乙型肝炎病毒血清型分布無差異。

HBV DNA聚合酶因缺乏矯正功能，乙肝病毒是突變頻率很高的DNA病毒，尤其在目前抗病毒藥物廣泛應用的情況下［9］，本研究中共有21例低水平乙型肝炎病毒表面抗原S區發生突變，突變率為65.6%，其中15例突變不會引起編碼抗原決定簇氨基酸突變，為無義突變，突變點分別是A514C、T562A各1例，G508A、G509A、A529G各2例，3例G511A、4例 G508C，而其他6例如 T531C、T581A各2例，G587A、A591C各1例核苷酸點突變均可引起抗原決定族編碼的氨基酸的改變如I126T、S143T、G145R、N146T，從而導致表面抗原結構改變。

乙型肝炎病毒表面抗原S區核苷酸編碼的變異可能導致臨床上常規檢測方法無法準確檢測而導致漏檢、誤診，也可能因為S區核苷酸編碼的變異導致臨床常規治療無效，總之，對低水平乙型肝炎病毒表面抗原患者S區序列的研究將為低水平乙型肝炎發病機制、流行病學以及個體化治療奠定基礎。

［1］Costa CA，Kimura LO.Molecular epidemiology of hepatitis B virus among the indigenous population of the Curuca and Itaquai Rivers，Javari Valley，State of Amazonas，Brazil［J］.Rev Soc Bras Med Trop，2012，4：457.

［2］Bamaga MS，Sobahy TM，Attar AA.Quantitative DNA analysis of very low－level hepatitis B viremic patients reporting to the gastroenterology clinic［J］.Saudi Med J，2011，32（2）：135.

［3］成 軍，孫長貴，陳 瑜.慢性HBV感染者低濃度HBsAg持續存在的臨床特點及分子流行病學研究進展［J］.現代檢驗醫學雜志，2010，25（2）：1.

［4］計玉仙，張志明，姜小建，等.化學發光法檢測低水平 HBsAg性能及臨床應用評價［J］.現代檢驗醫學雜志，2012，27（6）：101.

［5］王林川，陳 葳，張阿麗.應用nested－PCR對西安市乙肝病毒基因型的研究［J］.細胞與分子免疫學雜志，2011，27（7）：803.

［6］周 艷，劉發娣，劉金娣，等.兒童感染的乙型肝炎病毒S基因的分子特征［J］.南昌大學學報（醫學版），2011，51（6）：17.

［7］Zhu C T，D Dng CL.Characteristics of general distribution of hepatitis B virus genotypes in china［J］.Hepatobiliary Pancrea Dis Int，2009，8（4）：397.

［8］王學燕，陳欽艷，楊進業，等.廣西HBsAg無癥狀攜帶者HBV前S基因缺失突變的分子流行病學研究［J］.應用預防醫學，2012，18（2）：65.

［9］張志明，計玉仙.低水平乙型肝炎病毒表面抗原研究現狀［J］.國際檢驗醫學雜志，2012，33（3）：871.