臍帶源間充質(zhì)干細(xì)胞（hUMSCs）對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)肝纖維化干預(yù)作用的研究

宛 瑩，張世東，賁 亮，劉湘竹，李 超，聶德志＊

（1.四平中心人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，吉林 四平136000；2.吉林省拓華生物科技有限公司，吉林 四平136000）

肝纖維化是多數(shù)終末期肝病發(fā)展的共同階段，肝臟移植目前被認(rèn)為是治療肝纖維化的最有效方法之一，但由于肝源供應(yīng)不足、移植費(fèi)用昂貴、移植后并發(fā)癥嚴(yán)重等限制，難以推廣。生物人工肝治療同樣存在異體排斥反應(yīng)、體外培養(yǎng)細(xì)胞受限、解毒有限等問(wèn)題，不能從根本上解決肝細(xì)胞減少的病理生理過(guò)程。間充質(zhì)干細(xì)胞作為來(lái)自中胚層的一類成體干細(xì)胞，在干預(yù)肝纖維化過(guò)程中取得了一定的成效［1］。本實(shí)驗(yàn)將TAA誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠移植hUM－SCs，觀察肝纖維化在移植后的改善作用，旨在為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

雄性Balb/c小鼠，22－24g，購(gòu)自吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一周進(jìn)行實(shí)驗(yàn)環(huán)境適應(yīng)。

TAA購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；CD73，CD90，CD105抗體購(gòu)自美國(guó)BD公司；a－MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；Masson三染試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，具體操作遵照說(shuō)明書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 hUMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 足月剖宮產(chǎn)健康胎兒臍帶，經(jīng)產(chǎn)婦知情同意及醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，取自四平市中心醫(yī)院手術(shù)室，進(jìn)行常規(guī)分離［2］。選用流式細(xì)胞儀分析P5細(xì)胞檢測(cè)表型。

1.2.2 肝纖維化模型的建立 40只雄性Balb/c小鼠，隨機(jī)分成5組即空白組，肝纖維化模型組，hUMSCs移植自身對(duì)照組，肝纖維化模型hUMSC移植3天組和7天組。空白組每天經(jīng)尾靜脈內(nèi)注射生理鹽水0.1ml/mg，模型組經(jīng)腹腔注射給予TAA 200mg/kg，每周兩次連續(xù)6周后停止給藥，將肝纖維化模型組小鼠頸動(dòng)脈取血、處死，hUMSCs移植組通過(guò)尾靜脈注射hUMSCs 1×106個(gè)/0.2ml，分別于注射后的第3天和第7天對(duì)小鼠進(jìn)行處死。

1.2.3 小鼠血清中生化指標(biāo)測(cè)定和病理組織學(xué)檢查 小鼠麻醉處死，頸動(dòng)脈取血并收集肝臟標(biāo)本。測(cè)定血清中ALT和AST的活性。將肝臟組織固定、脫水、石蠟包埋、切片后，進(jìn)行Masson三染。具體方法參照說(shuō)明書(shū)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以（±s）表示，多組間均數(shù)差異性比較采用單因素方差分析（one－way ANOVA）。數(shù)據(jù)采用Prism 5.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 hUMSCs的分離培養(yǎng)及鑒定

hUMSCs成功從臍帶中分離培養(yǎng)，約6－10天可見(jiàn)hUMSCs細(xì)胞從組織塊邊緣爬出。傳至P3時(shí)形態(tài)學(xué)上顯示成纖維細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈漩渦樣生長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表型進(jìn)行分析，表達(dá) CD73，CD90和 CD105；不表達(dá) CD34，CD45，CD14，CD19，HLA－DR。結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的細(xì)胞為hUMSCs（圖1）。

圖1 FACS分析細(xì)胞免疫表型

2.2 肝纖維化對(duì)小鼠肝重體重的影響

研究表明由TAA誘導(dǎo)肝臟的變化和損傷的程度最初可表現(xiàn)為小鼠體重的變化。由表1可知在TAA連續(xù)6周的刺激下，造成模型組小鼠的體重顯著降低，肝重增加。通過(guò)移植hUMSCs3天和7天后均可不同程度的維持小鼠的體重在正常水平，降低肝重（P＜0.05）。其中以移植hUMSCs7天后效果更明顯（表1）。

表1 TAA誘導(dǎo)對(duì)小鼠體重肝重的影響

2.3 hUMSC移植后對(duì)小鼠血清中轉(zhuǎn)氨酶活性的影響

TAA刺激6周后顯著增加血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性，與正常組比較分別使ALT的水平增加了936%，AST的水平增加了90%。在移植hUMSCs7天和3天后ALT和AST活性降低接近正常。單獨(dú)移植hUMSCs組血清中ALT和AST活性與正常組水平接近（圖2）。

2.4 病理組織學(xué)Masson染色結(jié)果

Masson染色是用于檢測(cè)肝臟組織中特異的纖維化變性區(qū)域。空白組大鼠可見(jiàn)肝小葉中央靜脈管壁纖維組織染色，匯管區(qū)及小葉間隔可見(jiàn)少量纖維沉積；肝纖維化模型組在門靜脈周圍呈現(xiàn)較多的膠原聚集和橋連纖維的形成，與正常組比較形成了較多的纖維性隔膜。hUMSCs移植組膠原的沉積和纖維性隔膜的生成明顯減少。hUMSCs移植自身對(duì)照組膠原的聚集與正常組接近（圖3）。

圖2 TAA誘導(dǎo)的肝纖維化在移植hUMSCs后生化指標(biāo)的變化

圖3 hUMSCs移植后的Masson染色分析（×200）

3 討論

TAA誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型在血流動(dòng)力學(xué)、形態(tài)學(xué)及生化代謝的改變均與人肝纖維化最相似［3－5］，可作用在肝細(xì)胞、和蛋白合成酶上產(chǎn)生毒性作用，還可誘導(dǎo)肝的代謝紊亂，甚至肝壞死［6］。本實(shí)驗(yàn)采用TAA連續(xù)6周的誘導(dǎo)成功構(gòu)建了小鼠肝纖維化模型，通過(guò)hUMSCs移植后，明顯改善肝功能，使肝臟結(jié)構(gòu)形態(tài)恢復(fù)至正常水平，提示hUMSCs移植后使肝纖維化的發(fā)生進(jìn)程得到遏制并改善血生化指標(biāo)和修復(fù)損傷的肝臟組織。研究結(jié)果顯示hUMSCs移植后7天的抗肝纖維化效果明顯好于移植后3天，這表明采用hUMSCs移植干預(yù)肝纖維化的發(fā)生與移植后的作用時(shí)間存在一定的相關(guān)性，對(duì)于其能否隨時(shí)間延續(xù)發(fā)生進(jìn)一步的良性變化還需要繼續(xù)觀察，其相關(guān)的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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