基于TaqMan探針的幽門螺桿菌實時熒光定量PCR檢測方法的建立

石建玲，程 波，劉 珊，吳西釗，權蘭菊，丁姍姍，孫鎖柱

（中國人民解放軍第二炮兵總醫院，北京100088）

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，HP）自1983年被澳大利亞學者沃倫（Warren）與馬歇爾（Marshal1）［1］發現以來，國內外對它的分子生物學、致病機制、流行病學、相關疾病等方面進行了大量的研究［2－5］，現代醫學也已經證明，HP可以導致慢性胃炎、十二指腸腸炎、消化性潰瘍、胃癌、粘膜相關性淋巴瘤（MALT）等疾病的發生。WHO將HP作為胃癌的主要致病因子。因此，快速、準確的檢測HP的感染對大眾健康具有重要意義，對醫生治病也有巨大幫助。

實時熒光定量PCR技術具有高靈敏度和高特異性的優點，目前，國內已應用該技術檢測了百日咳鮑特菌［6］和沙眼衣原體［7］等多種微生物的感染。我們以HP高度保守的23SrDNA基因片段序列設計引物和探針，建立實時熒光定量PCR方法來檢測HP。

1 材料與方法

1.1 樣品

選取市售的HP菌株26695，對照菌株有Brevibacterium casei，Klebsiella pneumonia，Staphylococcus capitis，Microbulbifer elongates，Microbacterium sp，Streptococcus cristatus，Pichia anomala，EHEC，EIEC，Salmonella typhi，Dysentery bacterium，Vibrio Cholerae。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、dNTPs、pEASY－T載體、DNA提取的試劑盒（Omega E.Z.N.A.MicroElute Genomic DNA Kit）、大腸桿菌DH5a、幽門螺桿菌抗體、DAB顯色液、W－S銀染試劑、SMA4000核酸蛋白分析儀、ABI7500P實時熒光定量PCR擴增儀等。

1.3 引物和探針的設計

選取高度保守的HP特異性的23SrDNA基因序列，利用Primer Express 3.0軟件進行引物和探針的設計。引物和探針序列如下：

P1：gattcagtgaaattgtagtggagg

P2：tcccattagcagtgctaagttg

探針：5′－gcggcaagacggaaagaccccgtgg－3′

引物及探針由英俊公司合成，擴增目的片段長度為99bp，其他實時熒光定量PCR反應體系組分（ExTaq酶等）購自takar公司。

1.4 模板DNA的制備

按照購買的DNA提取試劑盒標明的方法進行基因組DNA的提取。

1.5 制備質粒

反應體系為20μl，以P1、P2為引物，反應條件為：95℃5min；95℃10s，60℃45s，40個循環。擴增得到的目的片段克隆至pEASY－T載體，轉化感受態細胞DH5α，提取質粒，測序驗證后作為熒光定量PCR的質粒標準品，梯度稀釋成1.0×107～1.0×101拷貝每微升作為陽性標準品。

1.6 實時熒光定量PCR反應條件的優化

以陽性質粒標準品為模板，在不同退火溫度下進行常規PCR反應，電泳分析擴增產物，確定最佳退火溫度。20μl體系Taqman熒光定量PCR反應程序為95℃ 5min；95℃ 10s，60℃ 45s，40個循環；應用矩陣法對熒光定量PCR的引物、探針濃度進行優化，以達到最佳反應條件。

1.7 標準品的擴增曲線及標準曲線的建立

以每微升拷貝數為107、106、105、104、103、102、101的質粒標準品為模板，最佳反應條件下在ABI－7500熒光定量PCR儀上檢測，得出各自的動力學曲線，儀器自動生成標準曲線。

1.8 敏感性試驗

取不同拷貝數的標準品，進行實時熒光定量PCR檢測。根據樣品拷貝數與CT值之間的線性關系和相關系數確定最小檢測量。

1.9 特異性試驗

對選取的對照菌株進行DNA提取，按照建立的實時熒光定量PCR方法進行測定，建立特異性試驗。

1.10 可重復性試驗

將105、104、103、102不同拷貝數的標準品重復測定3次，并進行統計學分析，根據變異系數確定檢測體系的可重復性。

1.11 臨床胃鏡標本檢測

對2012年5月至10月收集的100份胃鏡樣本進行檢測同時用免疫組化方法和銀染進行比較分析。

2 結果

2.1 標準品的擴增曲線及標準曲線的建立

每微升拷貝數為107、106、105、104、103、102、101的質粒標準品為模板進行實時熒光定量PCR檢測，得到標準品的擴增曲線（圖1），同時儀器自動生成標準曲線（圖2），線性關系為Y＝－3.605X＋42.853。標準品的擴增曲線顯示107－102有明顯的S型擴增曲線，而且指數增長期的曲線平行，說明PCR的擴增效率相近；不同稀釋度標準品之間的Ct值相差均勻，這與定量PCR的Ct值與起始拷貝數之間有嚴格的線性關系相一致。

圖1 幽門螺桿菌Taqman探針實時熒光定量PCR質粒標準品擴增曲線

圖2 幽門螺桿菌Taqman探針實時熒光定量PCR質粒標準品標準曲線

對標準曲線進行分析，R2值為1。因此，標準曲線在107至102拷貝每微升范圍內存在良好的線性關系。

2.2 檢測方法的敏感性

將以上拷貝數的質粒標準品為模板進行實時熒光定量PCR檢測，結果表明，該方法至少可以檢測出每微升102拷貝數的HP樣品。

2.3 檢測方法的特異性

用建立的實時熒光定量PCR的方法對HP和對照菌株進行檢測，只有HP為陽性，其余均為陰性，表明該方法具有良好的特異性。

2.4 重復性試驗

重復性分析不同拷貝數的標準品批內重復測定3次，其變異系數在1%－2%范圍之間，均在可接受的范圍內，說明本實驗建立的熒光定量PCR方法檢測幽門螺桿菌具有良好的穩定性。

2.5 臨床胃鏡標本檢測

實時熒光定量PCR以Ct值≤35并且擴增曲線呈 “S”形為陽性的判定原則。對100份樣本進行檢測，實時熒光定量PCR能檢出31份陽性，而免疫組化方法能檢出25份陽性，銀染方法能檢出28份陽性（圖3、圖4）。

圖3 免疫組化法染色陽性結果（10×40）

圖4 銀染法染色陽性結果（10×40）

3 討論

眾所周知，實時熒光定量PCR技術是一種直接檢測核酸的分子生物學技術，該方法靈敏度高、特異性好、操作簡單，它已廣泛應用于多種微生物感染的檢測［6，7］，國 內 外 亦 有 用 該 方 法 檢 測 HP 的 報道［8，9］。江南［10］和李廣云［11］的熒 光定量 PCR 檢測選用的是HP的16SRNA基因，而我們選用的是HP的23SrDNA基因，DNA比RNA穩定，不易降解，提取DNA比提取RNA的技術要求要低，操作簡單；同時江南采用的是SYBR GreenⅠ，而我們采用的是Taqman探針的方法，Taqman探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在5′末端，淬滅基團連接在3′末端，一分子的產物生成伴隨著一分子的熒光信號的產生，因此Taqman探針檢測的是積累熒光，由于增加了探針的識別步驟，它的特異性更高。而SYBR GreenⅠ屬于非探針類，是一種能與雙鏈DNA結合發光的熒光染料，由于它不能識別特定的雙鏈，因此它的特異性較差，對PCR反應中的非特異性擴增或引物二聚體也會產生熒光，所以會有假陽性的發生。

用該方法與免疫組化、銀染共同檢測100例臨床胃鏡標本，結果顯示，實時熒光定量PCR方法具有較高的敏感性，可以大大降低漏檢率。免疫組織化學和銀染是將所取的胃黏膜標本切片染色鏡檢，通過實踐發現。免疫組織化學和銀染容易發生染液的雜質干擾，產生假陽性，它的敏感性和特異性都依賴于觀察者的經驗和技術。

本研究結果顯示，所建立的實時熒光定量PCR方法具有以下特點：（1）檢測范圍寬，在107－102copies/ul范圍內均呈現良好的線性關系，相關系數為1；（2）靈敏度高，可檢測102copies/ul的樣本；（3）特異性高，與多種細菌均無交叉反應。（4）檢測速度快，整個PCR反應過程僅需70min。（5）重復性好，不同拷貝數的標準品批內重復測定3次，其變異系數在1%－2%范圍之間范圍。

實時熒光定量PCR檢測方法是近年來應用較為廣泛的一種檢測方法，具有快速準確等優點。本文從引物和探針的設計、PCR程序的設計等方面建立了HP檢測的一種方法，是對目前臨床HP檢測方法的一種補充與完善，具有重要的臨床意義。

［1］張發云，楊真威，李國明等.幽門螺桿菌與2005年諾貝爾醫學獎［J］.生物化學與生物物理進展.2005，32（11）.

［2］胡伏蓮 幽門螺桿菌研究從“認識”到“再認識”［J］.中華醫學雜志，2006，86（38）：2665.

［3］黃世桐，陳 哲.幽門螺桿菌相關疾病的研究進展［J］.醫學信息，2011，24（11）.

［4］中華醫學消化病學分會.幽門螺桿菌若干問題的共識意見［J］.中華消化雜志，2000，20：117.

［5］趙亞軍，于學文.幽門螺桿茵與慢性胃炎相關性的研究［J］.中國現代醫生，2009，47（18）：236.

［6］羅 煒，王 慧，劉利冬，等.百日咳鮑特菌BP283基因的實時熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.山東醫藥雜志，2012，52（3）：5.

［7］楊 娟.實時熒光定量PCR檢測泌尿生殖道感染患者沙眼衣原體的臨床應用［J］.放射免疫學雜志，2011，24（3）：342.

［8］Christine Lascols，Dominique Lamarque，Jean－Marc Costa.Fast and Accurate Quantitative Detection of Helicobacter pylori and I－dentification of Clarithromycin Resistance Mutations in H.pylori Isolates from Gastric Biopsy Specimens by Real－Time PCR［J］.Journal of Clinical Microbiology，2003：4573.

［9］高正琴，岳秉飛，賀爭鳴.Taqman MGB探針實時熒光定量PCR快速檢測幽門螺桿菌的研究［J］.臨床檢驗雜志，2012，30（7）.

［10］江 南.C13呼氣試驗和熒光定量PCR檢測幽門螺桿菌的比較［J］.現代醫院，2011，11（4）.

［11］李廣云，時昌文，景葉松，等.熒光定量PCR與 W－S銀染檢測幽門螺桿菌的對比研究［J］.山東大學學報（醫學版），2005，43（1）.